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重组人凝血因子Ⅸ在CHO细胞中的表达和纯化 被引量：1
1
作者 李德款 张航 +4 位作者 聂艳桃 李成 梁洪 寇鹏 费保进 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第11期1243-1246,共4页
目的在CHO细胞中表达并纯化人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)。方法将高表达hFⅨ的CHO细胞株在摇瓶中用无血清培养基进行批次培养和补料批次培养,收获补料批次培养上清,通过阴离子交换层析进行纯化,测定纯化产物的蛋白浓... 目的在CHO细胞中表达并纯化人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)。方法将高表达hFⅨ的CHO细胞株在摇瓶中用无血清培养基进行批次培养和补料批次培养,收获补料批次培养上清,通过阴离子交换层析进行纯化,测定纯化产物的蛋白浓度及hFⅨ活性,并进行SDS-PAGE分析。结果批次和补料批次培养表达的hFⅨ活性分别高达0.62和14.45 IU/mL。纯化后的hFⅨ比活性高达157.19 IU/mg。SDS-PAGE分析表明重组CHO工程细胞株能正确表达hFⅨ。结论成功在CHO细胞中表达并纯化了高比活性的重组hFⅨ蛋白,为进一步研制重组FⅨ药物奠定了基础。 展开更多
关键词 人凝血因子Ⅸ 中国仓鼠卵巢细胞 阴离子交换层析
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抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达
2
作者 费保进 雷韬 +3 位作者 姜晓 李小娇 沈虎 聂艳桃 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第10期1056-1059,共4页
目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为... 目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。 展开更多
关键词 人表皮生长因子受体2 单克隆抗体 中国仓鼠卵巢细胞
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人促红细胞生成素基因的优化及其在大肠杆菌中的表达
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作者 卢杨利 梁洪 +2 位作者 容新宗 王焰 龚曼琳 《国际生物制品学杂志》 CAS 2015年第6期292-299,共8页
目的对人促红细胞生成素（human erythropoietin，HuEPO）基因进行优化，提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率。方法对HuEPO基因的碱基序列进行设计，用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，构建高效表达重组（r）HuEPO（r... 目的对人促红细胞生成素（human erythropoietin，HuEPO）基因进行优化，提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率。方法对HuEPO基因的碱基序列进行设计，用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，构建高效表达重组（r）HuEPO（rHuEPO）的基因。设计rHuEPO的氨基酸突变位点，并对这些位点进行定点诱变，获得高亲水性的突变（M）rHuEPO（MrHuEPO）。对rHuEPO和MrHuEPO的三级结构进行预测及对比．验证突变位点设计的合理性。将rHuEPO和MrHuEPO基因克隆至表达载体pET-15b，并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行初步纯化和复性，比较复性时的rHuEPO和MrHuEPO可溶性和回收率，并用HuEPO活性检测试剂盒检测rHuEPO和MrHuEPO的活性。结果rHuEPO和MrHuEPO在大肠杆菌中得到成功表达，表达量均〉25％。三级结构预测对比结果表明，突变位点设计合理。rHuEPO和MrHuEPO的表达量无明显差别，但复性时MrHuEPO的可溶性（回收率〉90％）明显高于rHuEPO（回收率〈25％）。rHuEPO和MrHuEPO的比活分别为2.36×10^5和2．33×10^5IU／mg。结论成功构建了可在大肠杆菌中高效表达rHuEPO和MrHuEPO的基因，并通过定点诱变提高了复性时的MrHuEPO可溶性。 展开更多
关键词 红细胞生成素 重组 密码子 大肠杆菌 诱变 定点 疏水及亲水作用
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