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重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ蛋白复性过程中巯基浓度的监测 被引量：1
1
作者 王保成 李坤 +2 位作者 李春阳 蔡峰 秦娇荣 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第11期1646-1651,共6页
目的建立一种在重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis factor receptorⅠ，TNFRⅠ）蛋白复性过程中简单、可靠且易于操作的巯基浓度的监测方法，用以指导、监控蛋白复性过程及终点判断。方法通过测定3种不同巯基浓度检测方法的线... 目的建立一种在重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis factor receptorⅠ，TNFRⅠ）蛋白复性过程中简单、可靠且易于操作的巯基浓度的监测方法，用以指导、监控蛋白复性过程及终点判断。方法通过测定3种不同巯基浓度检测方法的线性范围及相关系数，建立适合重组人TNFRI蛋白复性溶液中巯基浓度的测定方法；动态监测蛋白复性过程中溶液巯基浓度变化及巯基浓度与复性蛋白生物活性的相关性；于蛋白复性48、96和144h取样，检测4℃保存3d和6d的稳定性。结果采用的3种巯基浓度监测方法中，方法3标准偏差值（standard error value，STDEV）较小，线性范围在0～12．5mmol／L，线性关系较好，R^2=0．9999，更适于蛋白复性溶液中巯基浓度的监测；随着蛋白复性时间的延长，巯基浓度呈明显的下降趋势（R^2=0．9891），当浓度在2～1mmol／L下降期间，是复性蛋白细胞活性上升最快期，而当巯基浓度降至1mmol／L及以下时，细胞活性达到最大值；蛋白复性144h后，细胞活性较为稳定。结论建立了一种简单、可靠且易于操作的巯基浓度测定方法，该方法对提高包涵体的复性效率具有重要的参考价值。 展开更多
关键词 蛋白质复性 巯基 浓度 细胞活性
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全人源抗体基因库的构建及抗表皮生长因子受体单链抗体的筛选
2
作者 余馨 何勇智 +6 位作者 丛聪 李坤 代云见 张勇侠 何静 王明蓉 何明跃 《国际生物制品学杂志》 CAS 2016年第3期122-127,共6页
目的从肿瘤患者外周血中构建全人源单链可变区抗体基因库，并采用真核核糖体展示技术高效筛选全人源抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单链抗体。方法采用PCR技术从52例晚期肿瘤患者外周血中构建大容量的... 目的从肿瘤患者外周血中构建全人源单链可变区抗体基因库，并采用真核核糖体展示技术高效筛选全人源抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单链抗体。方法采用PCR技术从52例晚期肿瘤患者外周血中构建大容量的全人源抗体基因库。针对EGFR抗原靶标，应用真核核糖体展示技术对该基因库进行高效富集筛选。通过大肠埃希菌表达体系对回收的基因库进行克隆、表达，并鉴定抗体活性。结果构建的全人源抗体基因库库容估算为4．3×1013。分子。对该基因库进行3轮富集筛选后，获得EGFR富集的单链抗体基因库。对回收基因库进行克隆、表达，并随机鉴定了49个克隆，获得结合力为10-8～10-7mol／L的2株全人源抗EGFR单链抗体。结论利用肿瘤患者外周血，结合核糖体展示技术可以较快获得具有医用价值的全人源单链抗体。 展开更多
关键词 基因文库 单链抗体 核糖体展示技术 外周血
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抗体药物的设计及其研究进展
3
作者 王明蓉 史晋海 +4 位作者 何勇智 代云见 余馨 丛聪 何明跃 《国际生物制品学杂志》 CAS 2016年第5期252-259,共8页
先进的展示技术为重组抗体的筛选和改造提供了有效而灵活的方法.通过展示技术可以获得更适用于诊断和治疗的优化分子,而后者不能直接通过动物免疫接种的方式获得.展示技术可通过自动化或与新一代测序技术和阵列技术联合应用得到进一步提... 先进的展示技术为重组抗体的筛选和改造提供了有效而灵活的方法.通过展示技术可以获得更适用于诊断和治疗的优化分子,而后者不能直接通过动物免疫接种的方式获得.展示技术可通过自动化或与新一代测序技术和阵列技术联合应用得到进一步提高,形成高通量筛选技术平台,用于筛选多种对应大量基因组编码靶标的抗体.从头设计抗体已开始成为制造新抗体的一种策略,但仍具有技术挑战性.然而,抗体-抗原结构数据库的不断增加和计算工具的不断开发,都表明这些挑战是可以克服的.预计未来以物理分子模拟知识为基础的计算方法,将成为提高抗体设计准确性和成功性的主要驱动力. 展开更多
关键词 药物设计 抗体 单链抗体 互补决定区 抗体亲和力
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3种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法比较
4
作者 杜天飞 于晓萍 +1 位作者 李春阳 刘兰军 《国际生物制品学杂志》 CAS 2024年第4期217-222,共6页
目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方... 目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方法及基于人白血病T细胞株(Jurkat细胞)的淋巴细胞毒流式检测方法测定3批次免疫血清及3批次原液的效价。免疫血清稀释128、256及512倍进行效价检测, 判定效价;原液稀释8~2 048倍进行检测, 计算半数效应浓度。结果中国药典方法与基于人外周血单个核细胞流式法检测3批次免疫血清的效价均为1∶512;基于Jurkat细胞流式法检测001批次免疫血清的效价为1∶512, 002与003批次免疫血清的效价为1∶256。3种方法测定3批次原液的效价结果与阳性对照Grafalon的活性水平相当, 不同方法检测的效价趋势基本一致。结论虽然3种方法测定免疫血清与原液的效价结果趋势基本一致, 但淋巴细胞毒流式检测方法操作更便捷, 且可定量测定半数效应浓度值。 展开更多
关键词 抗人T淋巴细胞免疫球蛋白 流式细胞术 淋巴细胞毒 效价
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实验设计法优化可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体包涵体的复性工艺 被引量：1
5
作者 秦娇荣 蔡峰 +2 位作者 赵兆 代云见 李春阳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第10期1142-1149,共8页
目的通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factorαreceptorⅠ,sTNFαRⅠ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化。方法采用DoE软件中的中心复合设计(Central Comp... 目的通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factorαreceptorⅠ,sTNFαRⅠ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化。方法采用DoE软件中的中心复合设计(Central Composite Design)建立二次模型(Quadratic Model),对复性工艺中游离巯基浓度(C_(-SH))和复性液蛋白浓度(C-Pro)2个关键参数进行优化。设置2个响应值:每克湿菌体中所获得的sTNFαRⅠ蛋白收率和每制备10 g sTNFαRⅠ蛋白所需复性体积(V-10 g),通过DoE软件对模型数据进行评估分析。在sTNFαRⅠ收率最高及V_(-10g)最小的前提下,采用二次模型响应面分析预测最优的复性参数值,并通过两次放大试验对优化结果进行验证。结果由2因素5水平2个Block共14组试验结果所建立的DoE响应面二次模型中心点重复性好,试验点均符合正态分布。响应面二次回归分析中,分别以sTNFαRⅠ收率和V_(-10g)作为响应值进行失拟检验的P均>0.05,模型失拟不显著。预测值和真实值接近,模型拟合度好。信噪比均>4,表明该模型有效,可用于复性工艺优化指导。通过以上模型得出:当C_(-Pro)为0.48 mg/m L,复性起始C_(-SH)为8.69 mmol/L时模型愿望值(0.643)最高,sTNFαRⅠ收率为16.38 mg/g,V_(-10g)为36.73 L。通过两次放大试验对优化结果进行验证,sTNFαRⅠ收率分别为11.34和9.72 mg/g,与优化前(收率均值5.1 mg/g)相比,有所提高。结论 DoE软件中心复合设计的二次模型可用于sTNFαRⅠ包涵体复性条件的筛选,且筛选结果为后续工艺放大提供了可靠的实验依据。 展开更多
关键词 实验设计 包涵体 复性 可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体 中心复合设计 响应面
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