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禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用 被引量：1
1
作者 李丹 谢芝勋 +7 位作者 李孟 罗思思 张民秀 谢丽基 华俊 粟永春 翟国胜 黄娇玲 《山西农业科学》 2023年第6期709-715,共7页
为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行... 为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。 展开更多
关键词 禽流感病毒 双重纳米PCR H7亚型 N2亚型
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微滴式数字PCR定量检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立 被引量：1
2
作者 谢志勤 谢芝勋 +14 位作者 张艳芳 范晴 谢丽基 万丽军 罗思思 李孟 张民秀 曾婷婷 黄娇玲 王盛 李丹 韦悠 李小凤 任红玉 阮志华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期668-673,719,共7页
旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)的方法,并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列,在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列,应用合成的引物和探针建立... 旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)的方法,并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列,在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列,应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法,并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果,本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒,且无交叉反应。灵敏性结果显示,本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线,其曲线呈良好的线性关系(R2=0.9994),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测,结果显示2种方法AEV阳性检出率均为4.62%(3/65)。结果表明,本研究建立的ddPCR方法检测AEV特异性高、灵敏好和稳定可靠,为绝对定量检测AEV提供了技术手段,对有效防控AEV有重要意义。 展开更多
关键词 微滴式数字PCR 禽脑脊髓炎病毒 VP1基因
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二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立
3
作者 谢志勤 谢芝勋 +14 位作者 张艳芳 李小凤 范晴 谢丽基 万丽军 罗思思 李孟 张民秀 曾婷婷 黄娇玲 王盛 李丹 韦悠 任红玉 阮志华 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1232-1241,共10页
为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针... 为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,ARV阳性检出率为13.0%(12/92),MS阳性检出率为9.8%(9/92),混合感染阳性率为2.2%(2/92)。结果表明,本研究建立的二重ddPCR方法在定量检测ARV及MS时特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ARV及MS提供了更敏感的检测技术手段。 展开更多
关键词 二重微滴式数字PCR 定量检测 禽呼肠孤病毒 鸡滑液囊支原体
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