[目的]构建敲除Toll Like Receptor 4(TLR4)基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs)...[目的]构建敲除Toll Like Receptor 4(TLR4)基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建p X459-sgRNAh TLR4重组质粒,并转入Ha Ca T中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞。测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果。[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85%和90%,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87%)。[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损。展开更多
目的构建害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)过敏原Lep d 2的原核表达系统,获得Lep d 2的重组纯化蛋白。方法通过双酶切pUC-Lep 2质粒,获取基因Lep d 2,并结合高保真PCR获取去信号肽基因rLep d 2,连接载体pET44a并转入表达菌株Rosetta...目的构建害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)过敏原Lep d 2的原核表达系统,获得Lep d 2的重组纯化蛋白。方法通过双酶切pUC-Lep 2质粒,获取基因Lep d 2,并结合高保真PCR获取去信号肽基因rLep d 2,连接载体pET44a并转入表达菌株Rosetta;利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和蛋白免疫印迹法分别进行诱导表达与鉴定;用盐酸胍溶解包涵体并进行透析复性;使用Strep II亲和填料来纯化目的蛋白。结果构建了Rosetta-rLep d 2的原核表达体系;rLep d 2蛋白在菌体内主要表达形式为包涵体,通过透析复性和亲和纯化获得了高纯度的rLep d 2蛋白。结论获得的重组rLep d 2蛋白可为下一步评价其过敏原性提供研究材料。展开更多
文摘[目的]构建敲除Toll Like Receptor 4(TLR4)基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建p X459-sgRNAh TLR4重组质粒,并转入Ha Ca T中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞。测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果。[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85%和90%,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87%)。[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损。
文摘目的构建害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)过敏原Lep d 2的原核表达系统,获得Lep d 2的重组纯化蛋白。方法通过双酶切pUC-Lep 2质粒,获取基因Lep d 2,并结合高保真PCR获取去信号肽基因rLep d 2,连接载体pET44a并转入表达菌株Rosetta;利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和蛋白免疫印迹法分别进行诱导表达与鉴定;用盐酸胍溶解包涵体并进行透析复性;使用Strep II亲和填料来纯化目的蛋白。结果构建了Rosetta-rLep d 2的原核表达体系;rLep d 2蛋白在菌体内主要表达形式为包涵体,通过透析复性和亲和纯化获得了高纯度的rLep d 2蛋白。结论获得的重组rLep d 2蛋白可为下一步评价其过敏原性提供研究材料。
