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肉眼可视环介导等温扩增方法快速检测新生儿唾液拭子巨细胞病毒
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作者 张畅斌 谭琪琪 +4 位作者 王梓宸 钟志成 刘攀 詹文丽 刘渊 《中国病毒病杂志》 CAS 2021年第5期351-357,共7页
目的探讨一种基于环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测新生儿唾液拭子中巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA的方法并评估其作为实时荧光聚合酶链反应(real-time polymerase chain reactio... 目的探讨一种基于环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测新生儿唾液拭子中巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA的方法并评估其作为实时荧光聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)补充方法用于先天性巨细胞病毒(congenital cytomegalovirus,cCMV)感染筛查的潜力。方法以HCMV UL54基因序列为检测靶标,以Mn^(2+)/钙黄绿素(calcein)作为指示剂建立肉眼可视的LAMP反应体系。对HCMV DNA高载量新生儿唾液拭子提取液作系列稀释,获得从1.2×10^(6)拷贝/ml至38拷贝/ml样品。荧光PCR检测限附近稀释度在63℃、66℃和70℃下重复10次LAMP检测。某温度下10次重复全部检出的最低HCMV DNA浓度确定为该温度下LAMP检测限。反应终止时间由某温度下检测限样品信号达峰值而最早非特异性扩增信号尚未出现的时点确定。数据分析使用SPSS19。以临床确诊EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(herps simplex virus typeⅠ,HSVⅠ)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(herps simplex virus typeⅡ,HSVⅡ)阳性DNA样品作LAMP,评估是否发生交叉反应。用水浴箱孵育代替PCR仪进行LAMP,肉眼观察结果,评估在无PCR仪的环境中使用效果。对50例HCMV阴性和50例模拟阳性新生儿唾液拭子DNA分别以LAMP法和实时荧光PCR法作平行检测,比较方法符合率。结果LAMP合适反应温度约为66℃,反应时间为30 min。检测限为150拷贝/ml,接近实时荧光PCR检测限75拷贝/ml水平。对EBV、HSVⅠ和HSVⅡ临床DNA样品无交叉反应发生。平行试验与实时荧光PCR方法符合率为100%(95%CI:92.87%~100%)。结论成功建立肉眼可视的适用于快速检测新生儿唾液拭子HCMV的LAMP检测方法。该法可以作为实时荧光PCR一个有益补充在新生儿唾液拭子cCMV感染筛查中推广应用。 展开更多
关键词 先天性巨细胞病毒感染 环介导等温扩增 新生儿筛查 感音神经性耳聋 出生缺陷
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