iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

1

作者 孔凡铭 张新伟 +3 位作者 于津浦 魏枫 李慧 任秀宝 《天津医科大学学报》 2011年第2期151-153,157,共4页

目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,... 目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。 展开更多

关键词 IASPP NIH3T3细胞 载体构建 P53

下载PDF 职称材料

沉默SOCS1共表达HMGB1及肿瘤相关抗原质粒构建

2

作者 霍佳 杨莉莉 +3 位作者 魏枫 于津浦 李慧 任秀宝 《天津医科大学学报》 2011年第1期10-14,共5页

目的:构建沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)并共表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及肿瘤相关抗原的质粒。方法:首先PCR扩增带有胰岛素信号肽序列的IRES片段和带有胰岛素信号肽序列的HMGB1片段,PCR拼接后取代IRES及EGFP片段装入pIRES-EGFP... 目的:构建沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)并共表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及肿瘤相关抗原的质粒。方法:首先PCR扩增带有胰岛素信号肽序列的IRES片段和带有胰岛素信号肽序列的HMGB1片段,PCR拼接后取代IRES及EGFP片段装入pIRES-EGFP载体中构建pIRES/sig-HMGB1质粒。然后PCR扩增带有NY-ESO-1编码序列及MAGE3(表位)编码序列亚克隆入pIRES/sig-HMGB1中后以此为模板扩增CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位)-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段。最后合成针对SOCS1的shRNA序列并连接入pENTR/U6载体,扩增U6-shSOCS1片段与CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位)-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段连接后装入pIRES-EGFP中,完成p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1质粒的构建并测序,酶切和PCR验证质粒。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。结论:成功构建可用于修饰DC疫苗的p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1质粒,为构建新型DC疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 细胞因子信号抑制因子1 高迁移率族蛋白B1 质粒 DC疫苗

下载PDF 职称材料

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

3

作者 徐冬 付晓达 魏枫 《天津医科大学学报》 2007年第4期539-542,共4页

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP+的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨... 目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP+的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。 展开更多

关键词 胞内抗体 K562细胞 BCR/ABL 酪氨酸激酶

下载PDF 职称材料

Vav1在吲哚胺2,3双加氧酶抑制T细胞中的作用初探 被引量：2

4

作者 李润美 魏枫 +3 位作者 于津浦 李慧 任秀宝 郝希山 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期786-791,共6页

目的:探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞中信号传导分子Vav1的分子机制。方法:应用稳定表达IDO的CHO细胞株,与纯化的外周血T细胞共孵育,检测IDO抑制T细胞增殖,诱导凋亡的情况,通过semi-quantitative RT-PCR检测T细胞中Vav1、IL-2 mRN... 目的:探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞中信号传导分子Vav1的分子机制。方法:应用稳定表达IDO的CHO细胞株,与纯化的外周血T细胞共孵育,检测IDO抑制T细胞增殖,诱导凋亡的情况,通过semi-quantitative RT-PCR检测T细胞中Vav1、IL-2 mRNA表达变化;Western blot及免疫沉淀技术检测Vav1蛋白表达及活化情况。结果:IDO可抑制T细胞的增殖。T细胞中Vav1和IL-2 mRNA水平明显下降(P<0.05)。而且,IDO还能使Vav1蛋白的表达和磷酸化水平降低。结论:研究证实在肿瘤局部产生于抗原呈递细胞或肿瘤细胞的IDO,可能通过抑制细胞内重要的信号传导蛋白Vav1的表达和磷酸化过程,使肿瘤浸润淋巴细胞的主动免疫受损,有利于肿瘤发生免疫逃逸。 展开更多

关键词 吲哚胺2 3双加氧酶 Vav1 IL-2 磷酸化

下载PDF 职称材料

利用基因表达谱筛选肝细胞癌中炎性微环境形成相关新基因的研究

5

作者 于津浦 Tine Casneuf +3 位作者 刘芃芃 Hans Winkler 任秀宝 郝希山 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2011年第21期1304-1309,共6页

目的:利用基因表达谱芯片筛选肝细胞癌(HCC)中的差异表达基因,并分析神经降压素(NTS)表达与HCC中炎性微环境形成的相互关系。方法:收集10例原发性HCC癌与癌旁组织,提取RNA进行Affvmetrix全基因组表达谱芯片检测,同时整合GEO数据库中同... 目的:利用基因表达谱芯片筛选肝细胞癌(HCC)中的差异表达基因,并分析神经降压素(NTS)表达与HCC中炎性微环境形成的相互关系。方法:收集10例原发性HCC癌与癌旁组织,提取RNA进行Affvmetrix全基因组表达谱芯片检测,同时整合GEO数据库中同芯片平台的亚洲人原发性HCC的mRNA表达谱数据30例,利用R2.9.0软件获得差异基因列表,应用Metacore2.5,Pathway studio6.0和Ingenuity1.0软件进行信号通路分析。最后,结合HE染色比较不同NTS表达水平的HCC标本中炎症反应强度。结果:所有RNA样品无降解,各芯片数据的信号强度分布均一。SMA聚类和信号通路分析结果显示40例HCC标本中存在一组独特亚群,呈现神经降压素(NTS)高表达,并伴有胞外间质重构、细胞粘附、白细胞移动、血管新生等生物学过程显著增强。HE染色证实NTS高表达标本中炎细胞浸润、纤维增生和血管生成明显高于NTS低表达的标本。结论:NTS高表达可能促进HCC中炎性环境的形成。 展开更多

关键词 肝细胞癌 神经降压素 炎性微环境 肿瘤转移 基因表达谱

下载PDF 职称材料

巢式序列特异性引物PCR方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合的临床应用研究 被引量：1

6

作者 于津浦 曹水 +2 位作者 李慧 安秀梅 任秀宝 《中国医药生物技术》 CSCD 2008年第5期325-331,共7页

目的探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性。方法选取25对拟行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例。... 目的探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性。方法选取25对拟行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例。采集供受者外周血提取基因组DNA,采用巢式PCR-SSP方法检测患者外周血中供者来源的HLA-DRB1位点,并计算母胎微嵌合阳性率。随机选取经巢式PCR-SSP证实嵌合阳性和阴性且供受者性别不同的患者各4例,采用荧光原位杂交(FISH)技术进行重复检测,并与巢式PCR-SSP方法的检测阳性率进行比较,同时采用噻唑蓝法检测这8例患者分别与其亲缘供者和HLA完全不相合无关第3人之间的混合淋巴细胞增殖反应(MLR),并计算增殖指数(SI)。结果巢式PCR-SSP方法灵敏度可高达0.001%,并具有较好的特异性。巢式PCR-SSP检测显示,在母子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为40%(6/15),而在父子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为0。巢式PCR-SSP方法的检测灵敏度与FISH技术相比明显增高,其检测阳性率分别为50%(4/8)和12.5%(1/8)。MLR检测显示,嵌合阳性患者对其亲缘供者和无关第3人外周血单个核细胞(PBMC)的SI分别为(0.949±0.023)、(1.320±0.095),嵌合阴性患者对其亲缘供者和无关第3人PBMC的SI分别为(1.133±0.036)、(1.245±0.069);嵌合阳性患者对其亲缘供者PBMC的增殖反应强度与嵌合阴性患者相比明显降低(P=0.001),并且也显著低于其对无关第3人PBMC的增殖反应强度(P=0.003)。结论巢式PCR-SSP方法灵敏度高、特异性好,适用于临床HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的快速检测。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 组织相容性试验 嵌合状态

下载PDF 职称材料

流式细胞术检测调节性T细胞方法的建立 被引量：1

7

作者 李花 李慧 +3 位作者 于津浦 付晓达 曹水 任秀宝 《中国医药生物技术》 CSCD 2008年第2期121-125,共5页

目的建立流式细胞术(FCM)检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)的方法,并观察紫杉醇联合卡铂治疗对晚期肺癌和乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tregs数量的影响。方法19例晚期肺癌和10例乳腺癌患者均给予紫杉醇联合卡铂方案化疗,于化疗前1d... 目的建立流式细胞术(FCM)检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)的方法,并观察紫杉醇联合卡铂治疗对晚期肺癌和乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tregs数量的影响。方法19例晚期肺癌和10例乳腺癌患者均给予紫杉醇联合卡铂方案化疗,于化疗前1d和化疗后第7天采集患者外周血,分别加入鼠抗人CD4-FITC(异硫氰酸荧光素)/CD8-PE(藻红蛋白)/CD3-PerCP(多甲藻叶绿素蛋白)、CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP、CD3-FITC/CD(16+56)-PE/CD45-PerCP单抗,并以分别加入同型鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗体作为阴性对照。采用流式细胞术(FCM)检测化疗前后外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞和CD4+CD25+Tregs、NK细胞所占比例并进行数据分析。实验重复3次。结果与化疗前比较,晚期肺癌和乳腺癌患者化疗后外周血CD4+CD25+Tregs的比例均明显降低(6.82%±3.11%vs.5.48%±2.13%,P=0.045;6.38%±1.84%vs.3.88%±1.69%,P=0.007);晚期肺癌患者化疗后外周血CD4+T细胞的比例升高(48.84%±16.44%vs.56.35%±14.50%,P=0.006),CD8+T细胞的比例降低(51.18%±16.44%vs.43.65%±14.50%,P=0.006),CD4+/CD8+T细胞比值升高(1.12±0.60vs.1.57±0.88,P=0.008),而CD3+T细胞和NK细胞的比例均无明显变化;乳腺癌患者化疗后外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞、NK细胞的比例和CD4+/CD8+T细胞比值均无明显变化。结论成功建立了FCM检测CD4+CD25+Tregs的方法,联合应用CD4、CD25、CD127检测CD4+CD25+Tregs简便可行、重复性好,检测结果可靠、准确,比较适用于临床检验。紫杉醇联合卡铂能够降低晚期肺癌和乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tregs的数量。 展开更多

关键词 流式细胞术 T淋巴细胞 调节性 白细胞介素7受体α亚单位 抗原 CD4 白细胞介素2受体α亚单位

下载PDF 职称材料

稳定表达膜结合型CD40配体CHO细胞系的建立和鉴定

8

作者 陈彦 于津浦 +2 位作者 李慧 曹水 任秀宝 《中国医药生物技术》 CSCD 2008年第1期40-44,共5页

目的建立稳定表达膜结合型CD40配体(CD40L)的CHO细胞系。方法将编码膜结合型CD40L的重组质粒pcDNA3.1-fCD40L用BgIⅡ和XhoⅠ酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向CHO细胞转染该重组质粒,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培... 目的建立稳定表达膜结合型CD40配体(CD40L)的CHO细胞系。方法将编码膜结合型CD40L的重组质粒pcDNA3.1-fCD40L用BgIⅡ和XhoⅠ酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向CHO细胞转染该重组质粒,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养,获得2个整合了fCD40L基因的CHO细胞(CHO-fCD40L)克隆。用RT-PCR、流式细胞仪分别从RNA和蛋白质水平对2个CHO-fCD40L克隆细胞中膜结合型CD40L的表达进行检测;ELISA法检测2个CHO-fCD40L克隆细胞培养上清液中可溶性CD40L(sCD40L)的含量。结果重组质粒pcDNA3.1-fCD40L经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段。该重组质粒转染CHO细胞后经克隆化培养获得2个CHO-fCD40L克隆,分别命名为C10、E11。RT-PCR检测显示C10、E11细胞中有膜结合型CD40LmRNA的转录;流式细胞仪检测显示C10、E11细胞表达CD40L蛋白达90%以上;ELISA法检测到显示C10、E11细胞培养液上清中有sCD40L蛋白表达。结论成功获得稳定表达膜结合型CD40L的CHO细胞系,为比较膜结合型CD40L与sCD40L的生物学功能奠定了良好基础。 展开更多

关键词 CD40配体 CHO细胞 质粒 转染

下载PDF 职称材料

新型树突状细胞疫苗的构建及功能的初步鉴定

9

作者 霍佳 杨莉莉 +3 位作者 魏枫 于津浦 李慧 任秀宝 《天津医药》 CAS 北大核心 2011年第4期318-321,共4页

目的:构建可同时实现沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激和肿瘤相关抗原负载的新型树突状细胞(DC)疫苗。方法:构建沉默SOCS1并共表达HMGB1及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的质粒(p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1)。体外... 目的:构建可同时实现沉默细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激和肿瘤相关抗原负载的新型树突状细胞(DC)疫苗。方法:构建沉默SOCS1并共表达HMGB1及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的质粒(p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1)。体外诱导单核细胞分化为DC,将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞。同时设立未转染组、shNC/GFP转染组和p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组。PCR和Western blot验证基因及蛋白表达后,酶联免疫吸附(ELISA)法检测DC细胞分泌的肿瘤坏子因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-12、IL-1及IL-6的变化。结果:经测序证实所构建质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒结构正确。成功将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC细胞,并在基因和蛋白水平验证NY-ESO-1的正确表达,HMGB1可在胞浆内表达。SOCS1 shRNA质粒shS可沉默SOCS1表达。p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DCTNF-α、IL-12、IL-1及IL-6分泌量较未转染组和shNC/GFP转染组升高(P<0.05)。结论:成功构建可同时实现沉默SOCS1、HMGB1刺激和肿瘤相关抗原负载的新型DC疫苗。 展开更多

关键词 细胞因子信号转导蛋白抑制因子 HMGB1蛋白质 树突细胞 癌症疫苗 质粒 转染 基因表达

下载PDF 职称材料

CD40/CD40L交联在CD4^+ T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究 被引量：7

10

作者 张维红 于津浦 +4 位作者 曹水 魏枫 安秀梅 任秀宝 郝希山 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期890-894,共5页

目的:探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4+T细胞(CD4+CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制。方法:体外扩增CIK细胞并纯化CD4+T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4+CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4+CIK激活前... 目的:探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4+T细胞(CD4+CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制。方法:体外扩增CIK细胞并纯化CD4+T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4+CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4+CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性。结果:CD4+CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4+CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-1124小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡。结论:CD4+CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡。 展开更多

关键词 CIK CD4+T细胞 凋亡 FAS/FASL CD40/CD40L

下载PDF 职称材料

STAT蛋白参与树突状细胞中IDO转录调控的研究进展 被引量：2

11

作者 王越 于津浦 任秀宝 《国际肿瘤学杂志》 CAS 2013年第3期163-165,共3页

吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）被认为是一种重要的内源性免疫抑制酶。研究证实IDO在肿瘤的发生发展中扮演十分重要的角色，肿瘤细胞不仅自身能表达IDO，而且还吸引树突状细胞（DC）表达IDO，参与肿瘤免疫耐受的形成。信号转导子与转录激活... 吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）被认为是一种重要的内源性免疫抑制酶。研究证实IDO在肿瘤的发生发展中扮演十分重要的角色，肿瘤细胞不仅自身能表达IDO，而且还吸引树突状细胞（DC）表达IDO，参与肿瘤免疫耐受的形成。信号转导子与转录激活子家族（STAT）是参与树突状细胞中IDO转录调控的主要信号蛋白家族，详细阐明DC中STAT蛋白对IDO表达的调控机制对于肿瘤治疗很有必要，将会帮助我们开发特异性更强、活性更高的IDO特异性抑制剂，并为抗肿瘤靶向治疗提供新的选择。 展开更多

关键词 反式激活(遗传学) 细胞因子信号转导蛋白抑制因子 树突细胞 吲哚胺2 3双加氧酶

原文传递

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

12

作者 董文 杨莉莉 +1 位作者 孙健 刘增君 《海南医学》 CAS 2008年第3期37-39,共3页

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、W... 目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 人骨形成蛋白-2成熟肽 毕赤酵母 表达

下载PDF 职称材料