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miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证
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作者 李亚冲 刘颖 朱恩东 《天津医科大学学报》 2020年第3期204-208,共5页
目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)报告载体中,并与miR-20a-5p的模... 目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad73′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad73′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。 展开更多
关键词 微小RNAS miR-20a-5p SMAD7 双荧光素酶活性检测 GFP抑制检测
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