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猪轮状病毒OSU株的培养特性与致病性研究 被引量：5
1
作者 黄小波 徐璐 +1 位作者 曹三杰 文心田 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期120-123,147,共5页
目的开展猪轮状病毒OSU株的细胞培养特性及致病性研究,确定轮状病毒培养的关键技术与致病规律。方法以MA104细胞培养病毒,对预处理病毒的胰酶浓度与时间、维持液中最佳胰酶浓度等关键条件进行优化,透射电镜观察病毒粒子形态,测定病毒TCI... 目的开展猪轮状病毒OSU株的细胞培养特性及致病性研究,确定轮状病毒培养的关键技术与致病规律。方法以MA104细胞培养病毒,对预处理病毒的胰酶浓度与时间、维持液中最佳胰酶浓度等关键条件进行优化,透射电镜观察病毒粒子形态,测定病毒TCID50,口服感染3d龄仔猪进行致病性试验。结果病毒经20μg/mL胰酶预处理1h,37℃吸附细胞2h,维持液最佳胰酶浓度为4μg/mL,病毒典型细胞病变为病变细胞葡萄串状堆积、胞浆相连、拉网等病变。透射电镜下病毒粒子呈圆形车轮状,直径约80nm。病毒感染3日龄仔猪10h后出现典型的黄色水样腹泻,感染42h后死亡,剖检可见胃内有凝乳块、肠壁变薄充满液体,盲肠、结肠充气。主要病变为:肠上皮细胞变性、坏死、脱落;固有膜高度扩张、充血和伴有轻微出血;粘膜上皮脱落,粘膜下层水肿、炎性细胞浸润等。结论研究阐明了轮状病毒OSU株的培养特性与致病特征。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 培养特性 人工感染 致病性
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猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析 被引量：4
2
作者 黄小波 杨恒 +4 位作者 曹三杰 文心田 李春松 廖晓丹 张鑫淼 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期848-853,共6页
为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基... 为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S-N融合基因 DNA疫苗 免疫原性
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减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建 被引量：2
3
作者 黄小波 李春松 +4 位作者 曹三杰 文心田 张鑫淼 杨恒 张亮 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期921-926,共6页
从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表... 从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 IL-6基因 减毒鼠伤寒沙门菌 构建 鉴定
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猪胸膜肺炎放线杆菌ArcA基因在低氧环境下的转录变化
4
作者 段丽丽 文心田 +1 位作者 曹三杰 黄小波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1388-1394,共7页
为研究低氧条件对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型ArcA基因表达的影响,并探讨ArcA在低氧环境中的作用机制,作者建立了体外培养模型,在低氧环境中培养APP,采用半定量RT-PCR方法,以看家基因recF为内参,检... 为研究低氧条件对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型ArcA基因表达的影响,并探讨ArcA在低氧环境中的作用机制,作者建立了体外培养模型,在低氧环境中培养APP,采用半定量RT-PCR方法,以看家基因recF为内参,检测ArcA基因在低氧条件下的表达水平。结果表明ArcA基因在常氧条件下不转录或低转录,而在低氧环境下高转录,并呈现转录量先升高后降低的趋势。这表明ArcA基因可能是胸膜肺炎放线杆菌潜在的毒力基因,在致病过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 半定量RT-PCR 猪胸膜肺炎放线杆菌 ArcA基因 缺氧
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猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建 被引量：14
5
作者 曹三杰 黄小波 +1 位作者 文心田 肖国生 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期121-124,共4页
采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验。结果表明，质粒PCR扩增和采用异丙醇沉... 采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验。结果表明，质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好，基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg／L，最佳探针质量浓度为3000μg／L，预杂交时间为1h，杂交时间为3～6h，杂交温度为48℃，以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因，确定了多重PCR扩增标记TGEV探针的最佳体系，Cy3-dCTP标记浓度为2．5μmol／L，构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 检测 基因芯片 构建
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猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离与鉴定 被引量：12
6
作者 黄小波 曹三杰 +2 位作者 文心田 杨恒 秦学远 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第8期58-61,共4页
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 鉴定 分离 H株 VIRUS 肠道传染病 临床症状 寒冷季节
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猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆与表达及间接ELISA方法的建立 被引量：2
7
作者 尹杰 杨恒 +5 位作者 曹三杰 黄小波 文心田 李洁萍 余正强 周军 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第1期7-10,共4页
针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点编码基因片段(SBC,下同)设计合成1对引物,用PCR方法扩增SBC基因,将该基因片段定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-32a-SBC。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG... 针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点编码基因片段(SBC,下同)设计合成1对引物,用PCR方法扩增SBC基因,将该基因片段定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-32a-SBC。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达大小约38 k D的蛋白,重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测TGEV抗体的间接ELISA(TGEV SBC-ELISA)方法。表明建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比血清中和试验高,可用于TGEV的检疫和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 克隆与表达 诊断
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