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PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达 被引量：1
1
作者 廖晓丹 曹三杰 +2 位作者 黄小波 唐莹 文心田 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期641-644,共4页
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因N端主要抗原位点片段(大小约为1 916bp)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)SC-L株S1基因(大小约为2 367bp),插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1... 采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因N端主要抗原位点片段(大小约为1 916bp)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)SC-L株S1基因(大小约为2 367bp),插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 构建 真核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达 被引量：8
2
作者 黄小波 钱洪喜 +2 位作者 曹三杰 文心田 马小平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1137-1141,共5页
用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定的pP... 用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定的pPIC9K-ORF7经SacⅠ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut+。重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性。本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 毕赤酵母
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TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX-S-N的构建及体外表达 被引量：2
3
作者 杨恒 曹三杰 +2 位作者 黄小波 文心田 秦学远 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期254-257,共4页
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S。从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基... 采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S。从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N。对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 N基因 构建 真核表达
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猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1
4
作者 黄小波 李娜 +5 位作者 文心田 曹三杰 余慧 杨恒 秦学远 尹杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期994-998,共5页
以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细... 以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3。分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1∶512、1∶105、1∶105,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳。间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 重组N蛋白 单克隆抗体 杂交瘤
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