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人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定 被引量：8
1
作者 李琛 林红 +5 位作者 刘新建 王忠灿 周镇先 陈乐如 管晓虹 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期575-578,616,共5页
目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为s... 目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 噬菌体展示 狂犬病毒 人源scFv抗体库
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HDGF真核表达质粒的构建、表达及其生物活性检测 被引量：2
2
作者 郭泽 龙卫国 +1 位作者 曹伯良 张爱霞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期602-606,共5页
目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernb... 目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernblot检测融合蛋白在转染细胞中的整合及表达。通过U87细胞增殖实验对HDGF-GFP融合蛋白进行初步功能鉴定。结果:pEGFP-HDGF表达质粒转染U87细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR、Westernblot结果证实在U87细胞中有HDGF-GFP融合蛋白的表达。细胞增殖实验的结果显示,稳定表达pEGFP-HDGF的U87细胞生长速率明显高于对照空载组细胞(P=0.006)。结论:pEGFP-HDGF真核表达质粒构建成功,且HDGF对于胶质瘤U87细胞株有着生长刺激作用,这将有助于胶质瘤发生发展的分子机制研究。 展开更多
关键词 肝癌衍生生长因子 绿色荧光蛋白 U87细胞株
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探讨不同实验条件对U87细胞体外增殖的影响
3
作者 龙卫国 郭泽 +1 位作者 曹伯良 张爱霞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期632-635,724,共5页
目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS... 目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS法检测细胞增殖能力。结果:HDGF表达水平下调后,U87细胞增殖能力受到抑制。在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,细胞增殖抑制率分别是18%、9%和28%。结论:在无血清Matrigel胶预先处理的培养条件下,能最大程度上反映出HDGFsiRNA对U87细胞增殖能力的抑制。 展开更多
关键词 RNA干扰 细胞增殖 培养条件
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