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可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析 被引量:7
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作者 邢启凯 李铃仙 +4 位作者 曹阳 张玮 彭军波 燕继晔 李兴红 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第24期5027-5038,共12页
【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback),影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并... 【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback),影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101-400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18-20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有� 展开更多
关键词 葡萄溃疡病 可可毛色二孢 生物信息学 分泌蛋白 信号肽 表达模式
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葡萄溃疡病菌外泌蛋白LtGH61A的致病力及基因表达模式 被引量:2
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作者 彭军波 李兴红 +3 位作者 张玮 周莹 黄金宝 燕继晔 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第24期4518-4526,共9页
【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为... 【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为进一步解析葡萄溃疡病菌的致病机理及病害防控提供理论依据。【方法】通过SignalP 4.0预测LtGH61A蛋白的信号肽;氨基酸序列同源比对结合基因功能注释,预测LtGH61A蛋白的功能;通过酵母互补试验分析LtGH61A蛋白的外泌特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LtGH61A在病原菌营养菌丝及侵染寄主不同阶段的表达量;借助RNA干涉(RNAi)对LtGH61A进行表达抑制;通过葡萄枝干离体接种试验,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌致病力的影响。通过比较菌落直径,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌菌丝生长速率的影响。【结果】信号肽预测表明LtGH61A蛋白N端具有一个长度为18个氨基酸的信号肽;基因功能注释推定LtGH61A的编码产物属于糖苷水解酶61(GH61)家族,能酶解纤维素类物质;互补蔗糖酶外泌缺陷型酵母YTK12结果表明,LtGH61A蛋白的信号肽具有外泌活性,能够引导酵母YTK12蔗糖酶的外泌;与营养菌丝阶段相比,LtGH61A的表达量在病原菌侵染阶段显著升高,并且在接种后48 h高达营养菌丝阶段的19倍;通过RNAi试验及qRT-PCR验证,获得了2个LtGH61A表达量明显降低的阳性转化子,分别命名为RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2;葡萄枝干离体接种试验结果显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子在葡萄枝干形成的病斑长度显著变短,约为野生型CSS-01s的55%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力;菌落直径比较显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子的菌落直径变小,约为野生型85%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的菌丝生长速率。【结论】LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力及 展开更多
关键词 葡萄溃疡病菌 外泌蛋白 致病力 表达模式 实时荧光定量PCR RNA干涉
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引起葡萄叶斑病的链格孢种类的初步鉴定 被引量:17
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作者 王彩霞 李兴红 +3 位作者 魏艳敏 燕继晔 王勇 张玮 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期175-183,共9页
为明确北京市大兴区、顺义区和山西省襄汾县葡萄树上叶斑病的病原菌,利用组织分离法对病样进行分离纯化,采用多基因系统发育学分析(ITS,Alt a 1和gpd)和形态学对纯化后菌株进行鉴定,并结合柯赫氏法则对其进行验证。结果表明,共获得37株... 为明确北京市大兴区、顺义区和山西省襄汾县葡萄树上叶斑病的病原菌,利用组织分离法对病样进行分离纯化,采用多基因系统发育学分析(ITS,Alt a 1和gpd)和形态学对纯化后菌株进行鉴定,并结合柯赫氏法则对其进行验证。结果表明,共获得37株链格孢属真菌菌株,分属链格孢Alternaria alternata、葡萄链格孢A. viniferae和乔木链格孢A. arborescens,柯赫氏法则检测结果显示接种菌株对所接叶片与果穗均具致病性,说明这3种链格孢种均为葡萄叶斑病的病原菌;葡萄链格孢为主要的病原菌,有28株,故将该类病害命名为葡萄链格孢叶斑病;此外,该类菌株在2~40℃之间均能生长,25℃为最适生长温度。 展开更多
关键词 葡萄 叶斑病 链格孢属 病原菌鉴定
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增殖植物和植物诱导抗性挥发物质对东亚小花蝽和浅黄恩蚜小蜂的嗅觉行为影响及田间诱集作用 被引量:9
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作者 杨帆 王甦 +3 位作者 张君明 张帆 谭晓玲 易图永 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期1250-1257,共8页
利用增殖植物与植物诱导抗性物质诱集天敌昆虫,实现对天敌昆虫种群的主动调控,已经成为现代保护型生物防治的热点。本研究针对捕食性天敌东亚小花蝽和寄生性天敌浅黄恩蚜小蜂,选择7种植物源诱集物质:玉米花粉、油菜花粉、琉璃苣花、金... 利用增殖植物与植物诱导抗性物质诱集天敌昆虫,实现对天敌昆虫种群的主动调控,已经成为现代保护型生物防治的热点。本研究针对捕食性天敌东亚小花蝽和寄生性天敌浅黄恩蚜小蜂,选择7种植物源诱集物质:玉米花粉、油菜花粉、琉璃苣花、金盏菊花、无味母菊花、苜蓿花、猫薄荷叶片,两种人工合成植物诱导抗性物质水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯作为气味源,分别在室内使用嗅觉仪检测以及在有机果园实际生产中使用天敌诱集装置,分析比较各自对东亚小花蝽和浅黄恩蚜小蜂的诱集作用。室内研究结果表明,水杨酸甲酯与玉米花粉对东亚小花蝽雌成虫吸引力最高,其次为茉莉酸甲酯。开花植物中,金盏菊花的诱集作用最佳。浅黄恩蚜小蜂趋向于选择两种人工合成挥发物,且对玉米花粉的选择高于其它植物源。有机苹果园内,水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯对东亚小花蝽的诱集作用十分显著。玉米花粉和金盏菊对东亚小花蝽诱集作用高于其它植物材料。浅黄恩蚜小蜂倾向选择水杨酸甲酯与茉莉酸甲酯,而植物源材料间的吸引力无显著差异。本研究结果表明植物诱导抗性物质与增殖植物物质均可以有效诱集东亚小花蝽和浅黄恩蚜小蜂,可以作为一种有效的保护型生物防治技术加以应用。 展开更多
关键词 东亚小花蝽 浅黄恩蚜小蜂 植物诱导抗性挥发物 增殖植物 嗅觉仪
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功能植物金盏菊对七星瓢虫温室定殖控害的增效作用研究 被引量:8
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作者 马亚云 张帆 +1 位作者 王甦 邸宁 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期276-282,共7页
利用蜜源植物为天敌提供栖境和营养的生物防治增效技术已广泛应用。金盏菊Calendula officinalis(Asterales:Asteraceae)由于生长快、花期长而具备作为蜜源性功能植物为天敌昆虫定殖、迁移和控害能力增效的潜力。本试验从室内种群定殖... 利用蜜源植物为天敌提供栖境和营养的生物防治增效技术已广泛应用。金盏菊Calendula officinalis(Asterales:Asteraceae)由于生长快、花期长而具备作为蜜源性功能植物为天敌昆虫定殖、迁移和控害能力增效的潜力。本试验从室内种群定殖、诱集助迁和控害增效作用评价3个方面研究了金盏菊对七星瓢虫Coccinella septempunctata(Coleoptera:Coccinellidae)温室定殖控害的增效作用。试验表明,在金盏菊的伴存下七星瓢虫种群个体数在15 d和30 d时分别增长170%和320%,显著高于对照组。金盏菊伴存时番茄植株对七星瓢虫的诱集助迁作用随时间的延长而显著上升。控害增效作用评价试验表明,引入瓢虫15 d后,试验处理内各个区域间七星瓢虫个体数量和蚜虫密度均有显著差异,种植有金盏菊的小区内七星瓢虫个体数量显著大于对照组,蚜虫密度均显著小于对照组;引入瓢虫30 d时,不同区域间的七星瓢虫个体数量和蚜虫密度未见显著差异。本研究证明了金盏菊对七星瓢虫诱集助迁、温室内定殖及控害效果均有增效作用,为其作为功能性蜜源植物增加天敌释放效率和控害效果奠定了理论基础。 展开更多
关键词 金盏菊 功能植物 七星瓢虫 定殖 增效作用
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可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析 被引量:1
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作者 彭军波 李兴红 +3 位作者 张玮 刘梅 邢启凯 燕继晔 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期119-126,共8页
为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量... 为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。 展开更多
关键词 可可毛色二孢 β-1 4-葡聚糖内切酶 信号肽 酶活性
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斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h与小分子化合物的结合特征 被引量:8
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作者 李都 牛长缨 +1 位作者 李峰奇 罗晨 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第15期2616-2623,共8页
【目的】克隆斑翅果蝇(Drosophila suzukii)气味结合蛋白56h(odorant binding protein 56h,OBP56h)基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇... 【目的】克隆斑翅果蝇(Drosophila suzukii)气味结合蛋白56h(odorant binding protein 56h,OBP56h)基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 7.4)稀释至终浓度2μmol·L-1,配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L-1,以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐(4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonicacid dipotassium salt,bis-ANS)荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L-1 IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568μmol·L-1,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93μmol·L-1,柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32μmol·L-1,草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数� 展开更多
关键词 斑翅果蝇 气味结合蛋白 原核表达 竞争结合
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