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猪圆环病毒2型(PCV2) Cap基因原核表达及抗血清制备 被引量：5
1
作者 姜宇航 宋利娜 +7 位作者 许汪 杜寿文 陈竞 付婷婷 郝鹏飞 李秋璇 金宁一 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期237-241,共5页
Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重... Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。 展开更多
关键词 PCV2 Cap基因 原核表达 小鼠阳性血清
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PCV3 Cap基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量：3
2
作者 姜宇航 徐一鸣 +6 位作者 许汪 杜寿文 宋利娜 陈竞 郝鹏飞 金宁一 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2112-2117,2128,共7页
试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒... 试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTM上(含有双启动子),获得含有2个PCV3Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-BacTM感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 重组杆状病毒 CAP蛋白 表达
原文传递
表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选
3
作者 张克龙 郝鹏飞 +11 位作者 巫介棚 朱羿龙 许汪 韩继成 哈卓 杜寿文 花群义 曹琛福 郑敏 罗廷荣 金宁一 李昌 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第6期44-47,I0004,共5页
为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病... 为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性。PCR鉴定结果显示,VP 2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因。荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞。本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组痘苗病毒 BTV-16 VP2 EGFP 遗传稳定性
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1株登革Ⅰ型病毒的分离鉴定及系统进化分析
4
作者 王宇航 张星艳 +8 位作者 花群义 任琴 戴少波 李体远 金宁一 周伯平 吴诗品 李昌 杜寿文 《新发传染病电子杂志》 2020年第2期100-103,共4页
目的了解1株登革病毒分离株的来源及进化情况。方法分离获得1株登革病毒,通过对该毒株进行血清型分型鉴定及基因组序列测定,进而通过生物信息学方法对囊膜蛋白E进行系统进化分析。结果分离获得1株DENV血清Ⅰ型基因Ⅰ型毒株;且E基因的同... 目的了解1株登革病毒分离株的来源及进化情况。方法分离获得1株登革病毒,通过对该毒株进行血清型分型鉴定及基因组序列测定,进而通过生物信息学方法对囊膜蛋白E进行系统进化分析。结果分离获得1株DENV血清Ⅰ型基因Ⅰ型毒株;且E基因的同源性分析显示,与Malaysia 0802aTw、Singapore株、浙江17-45株、YN176282株、BNJH17108株的核苷酸同源性均在99%以上;氨基酸水平,与NJX-14株、浙江17-45株、Malaysia 0802aTw株、1208aTw株等多种毒株的E蛋白的同源性均为99.8%,表明这些毒株可能源于同一株原始毒株,且E蛋白序列遗传进化稳定,与2002年以来多株广东省分离的毒株高度同源。结论近十年发现在我国的DENVⅠ型基因Ⅰ型遗传进化稳定,保守程度高,有利于针对该血清型登革病毒的防控。 展开更多
关键词 登革病毒 基因型 系统进化
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siRNA下调KMT2E表达对登革Ⅱ型病毒增殖的影响
5
作者 林吉辉 杜寿文 +2 位作者 李昌 花群义 吴诗品 《新发传染病电子杂志》 2020年第2期104-106,共3页
目的探究下调赖氨酸甲基转移酶2(lysine methyltransferase 2E,KMT2E)蛋白表达对登革Ⅱ型病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)增殖的影响,初步分析KMT2E在DENVⅡ增殖过程中的调控作用。方法针对KMT2E的编码序列设计3条小干扰RNA(small interfer... 目的探究下调赖氨酸甲基转移酶2(lysine methyltransferase 2E,KMT2E)蛋白表达对登革Ⅱ型病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)增殖的影响,初步分析KMT2E在DENVⅡ增殖过程中的调控作用。方法针对KMT2E的编码序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染293T细胞以筛选出下调KMT2E表达效率最高的siRNA,并用实时荧光定量分析DENVⅡ在KMT2E表达下调后的增殖情况。结果编号为1的siRNA(siKMT2E-1)有最高的下调KMT2E蛋白表达效率,转染293T细胞后能明显抑制DENVⅡ增殖。结论KMT2E可能在DENVⅡ增殖过程中发挥正调控作用。 展开更多
关键词 登革Ⅱ型病毒 赖氨酸甲基转移酶2E 小干扰RNA
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