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JSRV-env慢病毒过表达载体的构建及BEAS-2B细胞稳转株的建立
1
作者 杨小林 杜晓悦 +4 位作者 段续接 张培 陈思旭 王振玲 刘淑英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期2228-2236,共9页
通过构建过表达JSRV-env的慢病毒载体,筛选获得稳定表达Env的人支气管上皮细胞株(human bronchial epithelial cells-2b,BEAS-2B),检测Env对细胞增殖能力和迁移能力的影响。PCR扩增目的基因env,将其插入pMT194质粒中,构建pMT194-JSRV-en... 通过构建过表达JSRV-env的慢病毒载体,筛选获得稳定表达Env的人支气管上皮细胞株(human bronchial epithelial cells-2b,BEAS-2B),检测Env对细胞增殖能力和迁移能力的影响。PCR扩增目的基因env,将其插入pMT194质粒中,构建pMT194-JSRV-env慢病毒过表达质粒,将重组质粒同包装辅助质粒混合后与转染试剂复合物共转染293T细胞。在收集、纯化浓缩病毒后,感染BEAS-2B细胞并优化感染条件。根据慢病毒载体携带的抗性基因puro,用嘌呤霉素(Puro)筛选稳定细胞株。通过qPCR和Western blot从转录和翻译水平检测目的基因表达,通过CCK-8检测细胞增殖能力和划痕试验检测细胞迁移能力。结果显示:目的基因env扩增成功,并将其重组插入pMT194载体,酶切鉴定与预期相符,pMT194-JSRV-env表达载体构建成功;转染293T细胞env表达量极显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.001),JSRV Env重组慢病毒平均滴度为1.03×10~9 IU/mL;慢病毒感染BEAS-2B细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为40,筛选细胞株的最佳Puro质量浓度为0.3 mg/L;荧光显微镜显示BEAS-2B细胞表达红色荧光;qPCR和Western blot检测结果均表明env表达量在试验组中极显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.001),Env-FLAG融合蛋白在宿主细胞成功表达;相较于空白对照组和阴性对照组,试验组细胞的增殖能力及迁移能力显著增强(P<0.05)。结果表明,成功构建JSRV-env慢病毒过表达载体,筛选出稳定表达Env的BEAS-2B细胞株,Env能够显著增加BEAS-2B细胞的增殖和迁移能力。 展开更多
关键词 慢病毒载体 稳转株 囊膜蛋白 增殖 迁移
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兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体的制备及鉴定 被引量：3
2
作者 杨宏新 杨勇 曹贵方 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期362-367,共6页
目的制备兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体。方法构建pET-22b-SAS1B-His质粒,转化E.coli.BL21(DE3)细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导SAS1B重组蛋白表达。用层析纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔制备SA... 目的制备兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体。方法构建pET-22b-SAS1B-His质粒,转化E.coli.BL21(DE3)细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导SAS1B重组蛋白表达。用层析纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔制备SAS1B多克隆抗体。ELISA检测SAS1B抗体效价,Western blot和免疫组织化学法鉴定SAS1B抗体特异性。结果在构建pET-22b-SAS1B-His原核表达载体的基础上,在BL21(DE3)细胞成功诱导表达SAS1B重组蛋白。制备的兔抗人SAS1B多克隆抗体效价为1∶51200。SAS1B多克隆抗体能与SAS1B重组蛋白特异结合且能识别乳腺癌组织中的SAS1B蛋白。结论成功制备具有较好特异性的兔抗人SAS1B多克隆抗体。 展开更多
关键词 精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B) 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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JSRV Env通过Akt/mTOR信号通路调控绵羊绒毛膜滋养层细胞增殖 被引量：3
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作者 段续接 杨惠 刘淑英 《动物医学进展》 北大核心 2021年第9期47-52,共6页
利用已构建的JSRV Env慢病毒载体转染绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs),探讨Akt/mTOR信号通路的激活及其对细胞增殖的影响。以STCs为空白组,空病毒载体转染STCs为对照组,JSRV Env慢病毒载体转染STCs为试验组,通过Western blot检测Akt、p-Akt... 利用已构建的JSRV Env慢病毒载体转染绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs),探讨Akt/mTOR信号通路的激活及其对细胞增殖的影响。以STCs为空白组,空病毒载体转染STCs为对照组,JSRV Env慢病毒载体转染STCs为试验组,通过Western blot检测Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白的表达,并在JSRV Env转化细胞中加入mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin),利用噻唑蓝(MTT)比色法比较分析细胞增殖情况。激光共聚焦观察显示JSRV Env慢病毒转染STCs 72 h后,因稳定表达了Env蛋白而出现大量红色荧光信号;Western blot结果显示,与空白组和对照组相比,试验组有p-Akt和p-mTOR的显著表达(P<0.05);MTT比色法分析结果显示,与空白组和对照组相比,试验组的细胞增殖能力显著上调(P<0.05)。JSRV Env转化细胞中加入雷帕霉素后,MTT比色法分析结果显示,与JSRV Env慢病毒转染STCs组相比,细胞增殖能力显著下调(P<0.05);Western blot结果显示,雷帕霉素作用72 h后mTOR表达显著下调(P<0.05)。综上可知,JSRV Env慢病毒激活了STCs中的Akt/mTOR信号通路,参与调控细胞增殖。研究结果为进一步探究JSRV Env诱导细胞转化、参与细胞增殖等生物学作用的探讨提供了基础的参考资料。 展开更多
关键词 慢病毒载体 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白 Akt/mTOR信号通路 细胞增殖
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内蒙古包头市1例绵羊肺腺瘤病的诊断与病毒env基因分析 被引量：1
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作者 段续接 杜晓悦 +5 位作者 张培 王金玲 丁玉林 张良 李慧萍 刘淑英 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 2022年第5期16-22,共7页
绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的慢性、进行性、接触性绵羊肺肿瘤疾病。本研究通过尸体剖检、病理组织学、PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法确诊了1例... 绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的慢性、进行性、接触性绵羊肺肿瘤疾病。本研究通过尸体剖检、病理组织学、PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法确诊了1例绵羊肺腺瘤病,用病毒env基因测序结果进行基因结构和遗传进化分析。病理诊断结果显示,尸体剖检见肺肿大且质地坚实,肺表面有大量白色结节,肺叶上有数个有光泽的实变区,肺切面可见大面积实变区;光镜下可见肺泡Ⅱ型上皮细胞增生明显,呈立方状或柱状生长形成典型的“菜花样”腺瘤灶,肺泡腔内可见巨噬细胞。在病原(JSRV)的env和U3区分别设计两对引物的PCR检测结果显示,所扩增的目的条带大小与预期扩增片段大小一致,同时序列分析结果显示JSRV env与本实验室上传至GenBank中的参考序列JQ837489同源性为97.7%,JSRV env与JQ837489和新疆株KP691837聚为一支,亲缘关系较近;采用本实验室制备的JSRV的囊膜蛋白(Env)的多克隆抗体为一抗进行免疫组织化学检测,结果显示在增生的肺泡Ⅱ型上皮细胞中出现棕黄色深染的阳性信号;蛋白免疫印迹实验检测肺组织中JSRV Env相对表达量的结果显示,在80 kDa处表达特异性条带。研究结果表明,内蒙古包头地区已存在JSRV感染病例,这为今后OPA的诊断提供参考依据。 展开更多
关键词 绵羊肺腺瘤 绵羊肺腺瘤病毒 病理学 免疫组织化学 PCR
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