猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用 被引量：3

1

作者 杨利 张浩明 +2 位作者 于晓明 侯立婷 郑其升 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期822-828,共7页

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条... 为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40960,是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%~4.49%和1.90%~8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV IgA抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其� 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 IgA检测 捕获ELISA 猪初乳

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立 被引量：3

2

作者 刘鑫欢 何苗锋 +6 位作者 张纹纹 程子龙 毛立 杨蕾蕾 刘茂军 白娟 李文良 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2457-2462,共6页

为了建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白抗体的阻断ELISA方法,以BVDV-1重组E2蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的BVDV-1 E2蛋白的单克隆抗体作为检测抗体,经过一系列的条件筛选与优化,建立阻断ELISA方法,并对该检测方... 为了建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白抗体的阻断ELISA方法,以BVDV-1重组E2蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的BVDV-1 E2蛋白的单克隆抗体作为检测抗体,经过一系列的条件筛选与优化,建立阻断ELISA方法,并对该检测方法的特异性、敏感性和与中和试验结果的符合率进行测定。经优化后的最佳反应条件:抗原包被质量浓度为0.25 mg/L;酶标单抗稀释度为1∶2000,37℃孵育1 h;待检血清稀释度为1∶8,37℃孵育1.5 h;37℃避光显色10 min。使用该方法对87份BVDV阴性牛血清进行检测,确定当待检血清的阻断率≤21.13%时,该血清为阴性;阻断率≥26.86%时,该血清为阳性。该方法检测BVDV-2、边界病病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型、口蹄疫病毒、布鲁菌、副结核及牛支原体阳性血清均无交叉反应;最低可检出中和效价为8的阳性血清。用该方法检测105份临床血清样品,与血清中和试验总符合率为93.33%,且阻断率与中和抗体效价呈正相关。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法特异性好、灵敏度高、操作简便,为BVDV流行病学调查及免疫效果评估提供了一种新的技术手段。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 阻断ELISA 单克隆抗体 中和试验

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猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定 被引量：1

3

作者 谢青云 邢蕙萱 +4 位作者 于岩飞 袁厅 熊祺琰 熊富强 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期271-281,共11页

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗... 猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 解旋酶RuvA DNA结合 多克隆抗体

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一株GⅠ-19基因型禽传染性支气管炎病毒基因序列分析及致病性研究

4

作者 武奇 徐梦成 +3 位作者 魏邓乐 张雪花 李丁 梅梅 《中国家禽》 北大核心 2024年第9期94-102,共9页

为了解传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异及致病性,试验对江苏某鸡场发病鸡进行病原分离和鉴定,并对分离株S1基因进行同源性、遗传进化树、糖基化位点、S蛋白裂解位点和致病性分析。结果显示:从发病鸡肾脏组织中分离并鉴定到1株IBV,该... 为了解传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异及致病性,试验对江苏某鸡场发病鸡进行病原分离和鉴定,并对分离株S1基因进行同源性、遗传进化树、糖基化位点、S蛋白裂解位点和致病性分析。结果显示:从发病鸡肾脏组织中分离并鉴定到1株IBV,该分离株经SPF鸡胚盲传5代后,可引起典型的侏儒胚特征病变,其S1基因大小为1620 bp,分离株被命名为CK/CH/WJ215;CK/CH/WJ215与GⅠ-19基因型毒株S1核苷酸序列相似性为94.3%,与流行优势基因型GⅠ-19属于同一分支;RDP4重组分析显示该分离株S1蛋白不存在重组事件;进一步糖基化位点分析表明,与常用疫苗株相比,CK/CH/WJ215 S1蛋白在第51、77、103、138、163、178、247、276、283、530位点出现变异,值得注意的是,与H120疫苗株和QXL87疫苗株相比,CK/CH/WJ215 S1蛋白分别在138和530位出现了新的糖基化位点;7日龄SPF鸡致病性试验显示,该分离株可导致SPF鸡100%(15/15)发病,66.7%(10/15)死亡,并且导致严重的肾脏病变;感染鸡从第2天开始持续排毒,直到第21天气管和泄殖腔排毒率仍为80%(4/5)和100%(5/5)。研究表明,从江苏某鸡场发病鸡群种分离的GⅠ-19基因型IBV对SPF雏鸡具有很强的致病性,结果为该地区传染性支气管炎流行病学及防控提供参考。 展开更多

关键词 传染性支气管炎病毒 GⅠ-19基因型 S1基因 致病性

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猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

5

作者 王海燕 张珍珍 +2 位作者 倪博 刘蓓蓓 冯志新 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期216-226,共11页

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道... 【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白,被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手,分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用,揭示Mhp引起炎性损伤的新机制,为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cells,PBECs)感染模型和猪体感染模型,通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法,分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定,构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时,设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭,通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中,通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因,后感染Mhp,利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法,明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变,主要组织病理表现为肺脏炎性损伤,同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后,体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明,Mhp可诱导肺脏炎性反应,抑制SPLUNC1表达。另一方面,体外PBECs中过表达SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少;siRNA干扰SPLUNC1后,Mhp感染引� 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 支原体-宿主相互作用 炎性反应 SPLUNC1

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滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

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作者 徐彬 孙玉 +12 位作者 王树 于岩飞 王晓丽 马孙婷 孙华伟 张敬峰 刘传敏 吕立新 冯志新 熊祺琰 邵国青 张小飞 欧阳伟 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期88-96,共9页

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白... 滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells,SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实Eno对SSCs具有黏附作用,且此黏附作用具有Eno浓度依赖性。以上证明MS Eno在病原感染和灭活苗免疫鸡中具有反应原性,并作为外膜锚定的细胞黏附素参与对关键宿主细胞SSCs的黏附,为后续深入研究Eno的致病和免疫相关功能提供了重要参考。 展开更多

关键词 滑液支原体 烯醇化酶 反应原性 细胞黏附

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基于明尼苏达沙门氏菌Re595脂多糖低毒改造的外膜囊泡佐剂活性研究

7

作者 张嘉雯 尹文竹 +5 位作者 王海燕 张金秋 邓碧华 卢宇 周明旭 马芳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3269-3281,共13页

【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构,含有丰富的细菌表面抗原,因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为OMVs的主要结构... 【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构,含有丰富的细菌表面抗原,因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为OMVs的主要结构,在诱导免疫活性的同时,也成为影响OMVs安全性的主要因素。因此,通过基因工程改造细菌LPS以生产安全高效的OMVs,是促进其生产应用的有效途径之一。【方法】以O抗原和大部分核心抗原缺失的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re595为研究对象,通过缺失酰基链编码基因msbB和导入新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)磷酸酶基因lpxE,减少类脂A上的酰基链和磷酸基团,从而获得低毒LPS;提取亲本株与改造株LPS与OMVs,比较其刺激免疫细胞的炎性反应,以OMVs作为免疫增强剂制备口蹄疫灭活疫苗,评价免疫活性。【结果】Re595经LPS低毒改造成功降低该菌OMVs的内毒素活性和炎性反应,进一步评价亲本株Re595与低毒改造株的OMVs免疫活性发现,LPS低毒改造虽降低了OMVs的炎性反应,但其免疫增强活性显著提高。【结论】本研究说明LPS低毒改造后可降低细菌OMVs毒性,并提高其免疫增强活性,该结果将为OMVs作为免疫佐剂的应用提供理论依据。 展开更多

关键词 外膜囊泡 免疫佐剂 脂多糖 内毒素活性 基因编辑

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猪鼻支原体临床分离株体外抗生素敏感性研究

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作者 邵佳 韦艳娜 +9 位作者 王佳 李俊 黄媛媛 华利忠 甘源 刘蓓蓓 冯志新 邵国青 王先炜 熊祺琰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期553-559,共7页

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏... 为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏感,其MIC_(50)为0.030μg/mL,MIC_(90)为0.125μg/mL;对多西环素与环丙沙星也较为敏感,MIC_(50)和MIC_(90)值均为0.50和1.00μg/mL;对泰乐菌素和泰万菌素的MIC呈现双峰分布;对替米考星和林可霉素的MIC_(90)值均达到≥128μg/mL,分别有29%和32%的菌株MIC≥128μg/mL,出现了明显的耐药趋势。本研究结果丰富了我国Mhr临床菌株的药物敏感性数据,为临床用药提供了数据支撑及合理指导。 展开更多

关键词 猪鼻支原体 临床分离株 药物敏感性

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中华绒螯蟹螺原体铁蛋白的表达、纯化和初步晶体学研究

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作者 杨悦 王慧 +7 位作者 王锐 马可 徐颖 张水军 张珍珍 陈蓉 孟庆国 冯志新 《激光生物学报》 CAS 2024年第3期227-235,共9页

铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体。支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异... 铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体。支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异。目前螺原体铁蛋白还未有相关研究。本研究发现,螺原体铁蛋白与包含支原体在内的其他物种铁蛋白均具有较低的同源性。利用大肠杆菌表达中华绒螯蟹螺原体铁蛋白(SeFer),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白能以可溶的形式表达于大肠杆菌细胞内。分别通过二乙氨基乙基(DEAE)弱阴离子交换层析、分子筛层析,获得高纯度的SeFer。在4℃和18℃,用坐滴气相扩散法对SeFer进行晶体筛选,该蛋白在多种条件下能生长晶体,通过同步辐射光源衍射,其晶体最好衍射至2.90?,属于I432空间群,收集的数据可用于后继结构解析。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)、动态光散射(DLS)以及SeFer分子筛出峰位置显示,经大肠杆菌重组表达的SeFer相对分子质量为400 kD左右,粒径大小为15 nm左右,与理论值接近。利用Alphafold 2对SeFer进行结构预测,发现其具有与其他铁蛋白类似的二十面体球状结构,但是其铁氧化活性中心与支原体铁蛋白保守位点存在差异。本结果不仅为研究SeFer的晶体结构提供了基础,也为疫苗载体提供了新的候选。 展开更多

关键词 中华绒螯蟹螺原体 铁蛋白 蛋白纯化 晶体结构

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新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

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作者 毕振威 王文杰 +1 位作者 刘雅坤 彭大新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期660-669,共10页

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及... 物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。 展开更多

关键词 A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32A(caANP32A) RNA聚合酶活性 哺乳动物适应性

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关于我国种猪场猪肺炎支原体净化的思考

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作者 冯志新 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第3期154-156,共3页

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪... 猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪肺炎支原体净化方案的经验与我国生猪养殖特殊性的分析,提出分群体、分阶段的“三步法”净化建议,并对我国猪肺炎支原体的净化提出了展望。 展开更多

关键词 种猪场 猪肺炎支原体 净化

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绵羊肺炎支原体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

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作者 王晓楠 张纹纹 +7 位作者 陈思宇 单依依 陈益 李文良 程子龙 杨蕾蕾 王金泉 刘茂军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1202-1208,共7页

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)的抗原快速定量检测方法,本研究通过单克隆抗体筛选和条件优化,建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法,建立的ELISA方法的最优条件为:单克隆抗体1A11浓度为105μg/m L,37℃孵育1 h后... 为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)的抗原快速定量检测方法,本研究通过单克隆抗体筛选和条件优化,建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法,建立的ELISA方法的最优条件为:单克隆抗体1A11浓度为105μg/m L,37℃孵育1 h后4℃过夜包被;用10 g/L BSA 37℃封闭1 h;与超声处理的样品作用1.5 h;检测抗体浓度为3.81μg/m L,37℃作用2 h;酶标抗体1∶4000稀释,37℃反应1.5 h;加入底物37℃避光反应10 min。建立的夹心ELISA方法批间和批内变异系数均低于10%,特异性、重复性、敏感性良好,本方法检测的抗原含量与MO的CCU呈正相关。本方法的建立为绵羊肺炎支原体的定量检测提供了新技术,可用于实验室MO培养物CCU含量的替代检测和MO疫苗生产过程中抗原的检测。 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 夹心ELISA 建立

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雾化疫苗研究进展

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作者 吴伟 郝飞 +1 位作者 谢星 冯志新 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1203-1213,共11页

近年来,随着黏膜疫苗及免疫技术的不断发展,针对呼吸道疾病免疫预防的雾化疫苗及相应雾化吸入免疫技术的报道与应用逐渐增多。雾化疫苗是通过雾化装置将液态和固态免疫原制成雾滴或气溶胶颗粒,以喷雾免疫或气溶胶免疫的形式进入人与动... 近年来,随着黏膜疫苗及免疫技术的不断发展,针对呼吸道疾病免疫预防的雾化疫苗及相应雾化吸入免疫技术的报道与应用逐渐增多。雾化疫苗是通过雾化装置将液态和固态免疫原制成雾滴或气溶胶颗粒,以喷雾免疫或气溶胶免疫的形式进入人与动物呼吸道及肺部,并诱导机体产生保护性应答的疫苗。雾化免疫能更好地诱导黏膜免疫应答,同时避免了注射带来的疾病传播风险和疼痛。20世纪50年代鸡新城疫疫苗的喷雾免疫研究拉开了动物呼吸道免疫的序幕,随后开展了鸡传染性支气管炎疫苗的喷雾接种,目前很多禽用疫苗的喷雾免疫已被广泛使用。猪用疫苗的气溶胶免疫研究起步较晚,难度也更大。20世纪70年代末以来,逐步在猪瘟疫苗、猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗及猪支原体肺炎疫苗上开展相应的气溶胶免疫研究。相比动物疫苗,人用疫苗的气溶胶免疫研究报道更多,主要集中在麻疹疫苗、结核疫苗和流感疫苗。2019年以来,新型冠状病毒肺炎疫苗的气溶胶免疫快速发展,目前在中国已被批准紧急使用。笔者就动物用及人用雾化疫苗研究现状进行系统陈述,总结分析了各类雾化疫苗的理化参数、安全性、体内趋向性、肺脏局部免疫应答、免疫接种效果,并提出未来在疫苗剂型与组份、雾化发生装置、雾化过程质控、免疫程序与效果评价等方面的研究需求。本综述可为后续相应的呼吸道黏膜疫苗研发提供参考。 展开更多

关键词 雾化疫苗 气溶胶 群体免疫 传染病防控

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基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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作者 白昀 谢青云 +6 位作者 欧阳伟 甘源 袁厅 赵东明 步志高 邵国青 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期300-310,共11页

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

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不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

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作者 刘镝钺 程子龙 +8 位作者 陈益 陈思宇 李文良 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 熊富强 刘茂军 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第4期72-77,共6页

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 BALB/C小鼠 致病性 基因型

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N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

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作者 董文宇 刘维龙 +8 位作者 胡波 范志宇 魏后军 仇汝龙 宋艳华 陈萌萌 葛雷 熊富强 王芳 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第12期183-187,共5页

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入... 将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 VP60蛋白 HBGAs 病毒样颗粒 免疫原性

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适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立 被引量：2

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作者 谢青云 易玮婕 +9 位作者 李嘉豪 白昀 谢星 袁厅 张越 冯余凡 赵东明 步志高 刘斐 冯志新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4311-4319,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的AS... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 sIgA抗体 量子点免疫试纸条 现场即时检验

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检测兔出血症病毒HBGAs表位抗体间接ELISA方法的建立 被引量：2

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作者 刘维龙 胡波 +8 位作者 董文宇 范志宇 魏后军 仇汝龙 宋艳华 陈萌萌 葛雷 熊富强 王芳 《中国养兔》 2023年第3期4-7,30,共5页

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60上HBGAs表位抗体的间接ELISA方法,将谷胱甘肽磁珠纯化的含HBGAs表位的重组蛋白包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被质量浓度为6μg/mL,标准阴阳性血清稀释度为1∶200... 为建立检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60上HBGAs表位抗体的间接ELISA方法,将谷胱甘肽磁珠纯化的含HBGAs表位的重组蛋白包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被质量浓度为6μg/mL,标准阴阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用5%脱脂乳,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶10000。经特异性试验、敏感性试验、血清抗体检测,结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性,也可以检测出疫苗免疫后不同时间兔血清的抗体水平变化。说明以HBGAs表位为包被抗原建立了间接ELISA方法,为RHD疫苗的免疫效力评估提供了可行的技术手段。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白VP60 HBGAs表位 间接ELISA

原文传递

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

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作者 杜改梅 王月 +3 位作者 茅慧华 雷卫强 储岳峰 刘茂军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1728-1737,共10页

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μ... 旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 小鼠 感染模型

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猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

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作者 黄媛媛 王佳 +6 位作者 陈嘉瑜 甘源 袁厅 冯志新 邵国青 王先炜 熊祺琰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1249-1256,共8页

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学... 本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。 展开更多

关键词 腹膜间皮细胞 原代培养 猪 猪鼻支原体

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