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血管生成抑制素基因工程大肠杆菌的高密度发酵研究 被引量：9
1
作者 周涟 罗进贤 张添元 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期228-234,共7页
用 5L发酵罐研究了E .coliTG1 pBVA2和E .coliTG1 pBVK1 3的高密度培养工艺 ,确定了诱导及补料策略 ,在不降低外源基因表达量的前提下 ,工程菌TG1 pBVA2高密度发酵菌体干重为 1 6 8g L ,hAGN(K1 - 4)的表达量为菌体总蛋白的 2 4 1 ... 用 5L发酵罐研究了E .coliTG1 pBVA2和E .coliTG1 pBVK1 3的高密度培养工艺 ,确定了诱导及补料策略 ,在不降低外源基因表达量的前提下 ,工程菌TG1 pBVA2高密度发酵菌体干重为 1 6 8g L ,hAGN(K1 - 4)的表达量为菌体总蛋白的 2 4 1 % ,相当于 1 39g L ;同样的方法 ,工程菌TG1 pBVK1 3菌体干重可达 1 6g L ,hAGN(K1 - 3)占菌体总蛋白 2 5 8% ,相当于1 45g L。 展开更多
关键词 大肠杆菌 工程菌 血管生成抑制素 高密度发酵
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人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析 被引量：3
2
作者 张爱联 罗进贤 +1 位作者 张添元 罗学斌 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期56-59,共4页
应用PCR技术从人胎肝cDNA文库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GS115 ,经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GS115 (pPIC9KA3)... 应用PCR技术从人胎肝cDNA文库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GS115 ,经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GS115 (pPIC9KA3)。再用G418筛选法 ,在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS_PAGE及Western印迹分析显示 :表达产物约占胞外蛋白的 43% ,相当于 94mg L ,并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。 展开更多
关键词 人血管抑制素 基因表达 毕节酵母 G418 血管生成
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内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析 被引量：2
3
作者 吴江雪 符武钊 +2 位作者 张添元 罗进贤 吴群悦 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期83-86,共4页
采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPIC9K,获得的重组质粒pPIC9K＿EDN转化毕节酵母GS115,构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastorisGS115(pPIC9K＿EDN)。SDS＿P... 采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPIC9K,获得的重组质粒pPIC9K＿EDN转化毕节酵母GS115,构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastorisGS115(pPIC9K＿EDN)。SDS＿PAGE分析结果显示:人内皮细胞抑制素在重组酵母GS115(pPIC9K＿EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵,经甲醇诱导48h,生物量达到250OD,分泌量为150mg L,发酵液经SPStreamline,SPSepharoseFF阳离子交换柱和SepharoseHeparinHiTrap柱纯化,产物纯度达到98%。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。 展开更多
关键词 人内皮细胞抑制素 基因表达 毕节酵母 高密度发酵 纯化 生物活性分析 肿瘤
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Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展 被引量：2
4
作者 潘英文 张爱联 +3 位作者 张添元 罗进贤 谭燕华 屈直 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期53-56,共4页
Pichia pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白。启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达。本文简要介绍了P... Pichia pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白。启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达。本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展。 展开更多
关键词 PICHIA PASTORIS 表达系统 启动子
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用E.coli表达Canstatin-N及其表达条件优化 被引量：2
5
作者 潘英文 张爱联 +3 位作者 张添元 苏东晓 屈直 罗进贤 《工业微生物》 CAS CSCD 2009年第3期51-55,共5页
以重组质粒pET-CN为模板设计引物CASN1和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoR I和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b(+)载体获得重组表达质粒pET-22b(+)-CN,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达Canstatin... 以重组质粒pET-CN为模板设计引物CASN1和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoR I和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b(+)载体获得重组表达质粒pET-22b(+)-CN,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0.1mmol/L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合his6的重组Canstatin-N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管生成活性。 展开更多
关键词 Canstatin-N 大肠杆菌 基因表达 血管生成
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高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶 被引量：1
6
作者 杨穗珊 易国辉 +3 位作者 屠发志 张添元 罗进贤 张爱联 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期64-66,共3页
目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBHⅡ酶。方法:PCR法扩增木霉的cbhⅡ基因。将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌。重组CBHⅡ酶的生产是在50 L生物反... 目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBHⅡ酶。方法:PCR法扩增木霉的cbhⅡ基因。将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌。重组CBHⅡ酶的生产是在50 L生物反应器中进行。连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h。结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L。表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBHⅡ。该研究为重组CBHⅡ的规模化生产打下基础。 展开更多
关键词 葡聚糖外切酶 P.PASTORIS 高密度发酵
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用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因
7
作者 易国辉 屠发志 +3 位作者 张爱联 张添元 屈直 罗进贤 《工业微生物》 CAS CSCD 2010年第4期29-33,共5页
用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发... 用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。 展开更多
关键词 纤维素二糖水解酶 毕赤酵母 基因表达 酶活力
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高密度发酵P.pastoris组成型表达纤维素二糖水解酶
8
作者 崔艳艳 易国辉 +3 位作者 屠发志 张添元 罗进贤 张爱联 《热带作物学报》 CSCD 2010年第8期1293-1297,共5页
用PCR法扩增里氏木霉cbhⅡ基因,并将其克隆到P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP9K-cbhⅡ。通过电转法将cbhⅡ基因整合到P.pastoris的基因组中,然后筛选高G418抗性的克隆作为工程菌菌种。在生物反应器中生产CBHⅡ,将20L发... 用PCR法扩增里氏木霉cbhⅡ基因,并将其克隆到P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP9K-cbhⅡ。通过电转法将cbhⅡ基因整合到P.pastoris的基因组中,然后筛选高G418抗性的克隆作为工程菌菌种。在生物反应器中生产CBHⅡ,将20L发酵液装入50L的发酵罐中,在发酵过程中连续64h补加甘油-PTM4,放罐时生物量为A600=170,CBHⅡ的表达量为75mg/L。其表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。 展开更多
关键词 纤维素二糖水解酶 毕赤酵母 基因表达 纤维素酶活力
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