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Isolation of metabolic products from the fungus Nectria sp.HLS206 that is associated with the marine sponge Gelliodes carnosa collected from the South China Sea
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作者 王瑞杉 巩婷 +1 位作者 朱平 程克棣 《Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences》 CAS 2012年第2期183-186,共4页
The sponge-associated fungus Nectria sp.HLS206,which belongs to the order of Hypocreales,was isolated from the marine sponge Gelliodes carnosa collected from the South China Sea.The secondary metabolites of the fungus... The sponge-associated fungus Nectria sp.HLS206,which belongs to the order of Hypocreales,was isolated from the marine sponge Gelliodes carnosa collected from the South China Sea.The secondary metabolites of the fungus were isolated.From the solid cultures,five compounds were purified,which are chalmicrin(1),hypocrealesate(2),fucosterol(3),stigmasterol(4) and β-sitosterol(5).The structures of the 5 compounds were elucidated by ESI-MS,1D and 2D NMR spectra(COSY,HMQC and HMBC).To the best of our knowledge,it is the first time compound 1 was isolated from the order of Hypocreales,and the spectral data of compound 2 are also firstly reported. 展开更多
关键词 Sponge-associated fungus Nectria sp. Secondary metabolites Spectral data
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基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用 被引量:5
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作者 支晓慧 王丽娜 +2 位作者 朱平 王伟 孔建强 《中国医药生物技术》 CSCD 2011年第5期330-335,共6页
目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗... 目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57)mg/L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。 展开更多
关键词 酵母菌 酿酒 DNA 核糖体 遗传载体 紫穗槐-4 11-二烯合酶
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同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响 被引量:5
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作者 李慧仙 朱平 《中国医药生物技术》 2013年第4期241-246,共6页
目的在目的基因原载体(DNA 模板)与克隆载体相同的条件下,探讨了 PCR 扩增片段(含目的基因)的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响,并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2... 目的在目的基因原载体(DNA 模板)与克隆载体相同的条件下,探讨了 PCR 扩增片段(含目的基因)的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响,并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2(2.4 kb)基因突变库的构建为例,设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列,并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段,运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆, PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp,此时连接效率最高,其阳性重组率高达90%左右,是常规酶切连接法的3倍。与后者相比,该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率,该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。 展开更多
关键词 定向分子进化 In-Fusion技术 同源区段 高通量克隆
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双分子荧光互补技术的应用与展望 被引量:3
4
作者 史彦薇 孔建强 安建梅 《药物生物技术》 CAS 2013年第5期443-447,共5页
双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的... 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,从而产生荧光。BiFC方法简单直观,具有可视性的特点,对温度敏感,荧光片段种类较多,被广泛地应用到不同的细胞中,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外,BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展,双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术,BiFC和FRET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术,拓宽了BiFC的应用。 展开更多
关键词 双分子荧光互补技术 蛋白质片段互补 荧光蛋白 蛋白质相互作用
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UDP-糖基供体的生物合成途径分析 被引量:3
5
作者 尹森 孔建强 《中国医药生物技术》 2016年第4期355-359,共5页
糖基化是生物体中重要的生化反应,它可发生于大分子化合物,如蛋白质的糖基化;也可发生于小分子化合物,如各种天然产物苷元的糖基化。执行化合物糖基化反应的催化酶为糖基转移酶。糖基转移酶的底物分为糖基受体和糖基供体。糖基受体可以... 糖基化是生物体中重要的生化反应,它可发生于大分子化合物,如蛋白质的糖基化;也可发生于小分子化合物,如各种天然产物苷元的糖基化。执行化合物糖基化反应的催化酶为糖基转移酶。糖基转移酶的底物分为糖基受体和糖基供体。糖基受体可以为生物大分子化合物如蛋白质、核酸,还可以为小分子化合物如各种植物或微生物的次生代谢产物。 展开更多
关键词 糖基 UDP 大分子化合物 生物合成途径 差向异构酶 催化酶 天然产物 生化反应 合酶 鼠李糖
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虎眼万年青皂苷OSW-1构效关系研究进展 被引量:3
6
作者 王志标 王伟 +1 位作者 程克棣 孔建强 《中国医药生物技术》 2013年第5期368-375,共8页
OSW-1是20世纪90年代日本科学家从虎眼万年青(Ornithogalum saundersiae)球茎中分离得到的一种甾体皂苷类物质,结构见图1。
关键词 虎眼万年青 皂苷类 构效关系 科学家
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甲羟戊酸途径代谢酶HMGL研究概述 被引量:2
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作者 王志标 王伟 +1 位作者 程克棣 孔建强 《中国医药生物技术》 2014年第1期48-52,共5页
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGL)是一种参与生物体内3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)代谢的重要酶类,在自然界中广泛存在,具有多种功能。作为HMGL作用的前体物质,HMG-CoA在生物体内主要有两方面作用。首先,HMG—CoA可... 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGL)是一种参与生物体内3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)代谢的重要酶类,在自然界中广泛存在,具有多种功能。作为HMGL作用的前体物质,HMG-CoA在生物体内主要有两方面作用。首先,HMG—CoA可在HMGL作用下形成酮体,酮体能够提供能量;其次,作为甲羟戊酸途径中一个重要中间体,可用于合成甾体、辅酶Q、萜类等生命活性物质。 展开更多
关键词 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 甲羟戊酸 代谢酶 HMG-COA 生物体内 前体物质 活性物质 裂解酶
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虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析 被引量:1
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作者 陈茜 王志标 +3 位作者 唐微 王伟 程克棣 孔建强 《中国医药生物技术》 2013年第4期247-253,共7页
目的构建虎眼万年青EST文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB法提取虎眼万年青鳞茎总RNA,通过SMART方法构建全长cDNA文库,获得库容大于3×106cfu/ml的均一化全长cDNA文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的EST序列进... 目的构建虎眼万年青EST文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB法提取虎眼万年青鳞茎总RNA,通过SMART方法构建全长cDNA文库,获得库容大于3×106cfu/ml的均一化全长cDNA文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的EST序列进行Blast分析(NR、NT、Swiss-Prot和KEGG)以及COG功能分类。结果获得1398条有效EST序列,含有1146条单一基因,cDNA文库平均插入片段长度在1.5kb以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与Syntaxin43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据Blast比对结果,推断这两个基因片段是同一个Syntaxin基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青cDNA为模板,通过常规的RT-PCR扩增得到全长Syntaxin基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青EST文库;并从中筛选得到一条和Syntaxin具有同源性的基因,实现了Syntaxin蛋白在大肠杆菌中的表达,为Syntaxin基因功能的鉴定奠定基础。 展开更多
关键词 基因文库 Qa-SNARE蛋白质类 虎眼万年青
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匹诺塞林合成生物学研究进展
9
作者 郭磊 孔建强 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期451-460,共10页
匹诺塞林是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物,具有很好的生物活性,如神经保护、抗菌、抗氧化等。2009年,匹诺塞林被CFDA批准为Ⅰ类注射新药,主要用于治疗急性脑卒中,现已经进入Ⅱ期临床试验阶段。匹诺塞林的良好成药性使其合成方法... 匹诺塞林是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物,具有很好的生物活性,如神经保护、抗菌、抗氧化等。2009年,匹诺塞林被CFDA批准为Ⅰ类注射新药,主要用于治疗急性脑卒中,现已经进入Ⅱ期临床试验阶段。匹诺塞林的良好成药性使其合成方法备受关注。匹诺塞林可以通过化学合成、植物提取和合成生物学技术制备。合成生物学技术是一种环境友好的工程化生物技术,代表未来匹诺塞林的合成发展方向。文中总结了利用合成生物学技术制备匹诺塞林的研究现状,并从选择酶的物种来源、提高丙二酰Co A含量、选择经济的底物及减弱中间产物的抑制作用等角度系统地总结了提高微生物合成匹诺塞林的策略。 展开更多
关键词 匹诺塞林 黄酮类化合物 合成生物学 发酵策略
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红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究
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作者 史彦薇 王志芳 +2 位作者 王伟 安建梅 孔建强 《中国医药生物技术》 CSCD 2012年第2期93-99,共7页
目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred... 目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。 展开更多
关键词 发光蛋白质类 酵母菌 酿酒 基因表
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催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
11
作者 刘星 孔建强 《中国医药生物技术》 2015年第6期540-543,共4页
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素P450(CYP450)氧化酶BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技... 甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素P450(CYP450)氧化酶BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用,基于细胞色素P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干P450 BM3突变酶的基础上,通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法,筛选出催化甾体羟基化的相关CYP450。根据易错PCR等定向进化技术获得了突变位点信息,进一步采用(饱和)定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析, 展开更多
关键词 蛋白质工程 P450氧化酶BM3 羟基化 定点突变 生物信息学分析 定向进化 测序技术 突变体 单加氧酶 活性氨基酸
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抗脑卒中新药匹诺塞林两种代谢产物的合成
12
作者 王冬梅 刘海涛 +1 位作者 童元峰 吴松 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1130-1132,1165,共4页
目的:合成匹诺塞林的两种体内代谢产物5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠及5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸。方法:以匹诺塞林为原料,吡啶作为溶剂和催化剂,与氯磺酸进行磺酸化反应后再成盐得到5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠。5-羟基-黄烷酮-7-O-... 目的:合成匹诺塞林的两种体内代谢产物5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠及5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸。方法:以匹诺塞林为原料,吡啶作为溶剂和催化剂,与氯磺酸进行磺酸化反应后再成盐得到5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠。5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸的合成同样以匹诺塞林为原料,经过乙酰化保护羟基,再选择性脱去保护基,然后与三-O-乙酰基-α-D-溴代葡糖糖醛酸甲酯进行糖苷化,再水解脱去保护基团得到目标化合物。结果:两个目标化合物的结构经1H-NMR、MS得到确证,纯度经HPLC检测均达到98%以上。结论:本文首次合成了5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠和5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸两种代谢产物,可作为新药匹诺塞林体内代谢研究的对照品。 展开更多
关键词 抗脑卒中药物 匹诺塞林 代谢产物 合成
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人β-分泌酶(BACE1)在毕赤酵母中分泌表达及纯化 被引量:3
13
作者 王鹏 赵颖 +1 位作者 朱平 方唯硕 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1655-1666,共12页
为了获得活性良好的重组人β-分泌酶(β-secreatase,BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组... 为了获得活性良好的重组人β-分泌酶(β-secreatase,BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达,结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性,SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白,并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除,得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现,这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1,这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异,这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L,这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。 展开更多
关键词 Β-分泌酶 糖基化 毕赤酵母 肽质量指纹图谱
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异环磷酰胺有关物质的合成 被引量:1
14
作者 付晖 田金龙 +2 位作者 李新鹏 吴松 贾娴 《中国药物化学杂志》 CAS CSCD 2015年第5期386-388,共3页
目的合成异环磷酰胺原料药中的一种有关物质。方法以3-氨基丙醇为原料,与三氯氧磷环合制得2-氯-1-氧杂-3-氮杂-2-磷杂环己烷-2-氧化物(3);以1-氨基-2-丙醇为原料,与氯化亚砜反应制得2-氯丙胺盐酸盐(5);化合物3与5经取代、酰化、还原得... 目的合成异环磷酰胺原料药中的一种有关物质。方法以3-氨基丙醇为原料,与三氯氧磷环合制得2-氯-1-氧杂-3-氮杂-2-磷杂环己烷-2-氧化物(3);以1-氨基-2-丙醇为原料,与氯化亚砜反应制得2-氯丙胺盐酸盐(5);化合物3与5经取代、酰化、还原得到有关物质3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯丙基)氨基]-1-氧杂-3-氮杂-2-磷杂环己烷-2-氧化物。结果与结论合成了异环磷酰胺原料药中的一种有关物质,其结构经1H-NM R、13C-NM R和M S谱确证,纯度在99%以上。该有关物质可作为异环磷酰胺原料药质量控制的对照品。 展开更多
关键词 异环磷酰胺 有关物质 合成
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