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非洲猪瘟病毒p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法的建立
1
作者 何佳依 邹艳丽 +11 位作者 王燕 刘珊 苗雨润 任炜杰 王振忠 白昀 陈欢 贾红 郑龙三 吴晓东 冯志新 钱莺娟 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1443-1450,共8页
为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪... 为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒和猪瘟病毒等常见猪源病原阳性血清无交叉反应;对ASFV阳性血清的敏感性能达到1∶12800;批内变异系数为7.95%,批间变异系数为9.18%,均小于10%。利用该方法与ID.vet商品化ELISA试剂盒分别检测130份临床猪血清,其阳性符合率为92.19%,阴性符合率为86.36%,总符合率为89.23%。综上所述,成功建立了ASFV p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法,为检测猪血清中ASFV特异性抗体提供了新的技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 pK205R蛋白 间接ELISA
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表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白重组腺病毒的构建及其吸附红细胞特性的研究 被引量：4
2
作者 常星 胡永新 +5 位作者 周昊 赵永刚 张永强 戈胜强 王建琳 吴晓东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1252-1257,共6页
为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-Y... 为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-YH),结果显示,在转染8 d后出现典型细胞病变,且经测序鉴定显示插入片段与预期一致,表明拯救出一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH。利用Adeno-X快速滴度试剂盒测定F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度,结果显示F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度分别为1.36×10^(8)IFU/mL、1.47×10^(8)IFU/mL、2.16×10^(8)IFU/mL。利用直接免疫荧光试验(DFA)和western blot对F3代Ad5-CD2vUb-YH在Vero细胞中CD2v蛋白的表达进行鉴定,DFA鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-FITC抗体特异性结合,细胞质内呈现特异性绿色荧光信号;Western blot鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-HRP抗体和ASFV阳性血清均可进行特异性反应,在约102 ku和31 ku处均可见两条特异性条带,以上结果均表明CD2v蛋白得到了有效表达;进一步利用蛋白质谱对CD2v蛋白位置的胶块进行肽段序列测定并分析,结果显示其肽段序列与数据库中ASFV CD2v蛋白氨基酸序列匹配度为11%。对F3代Ad5-CD2vUb-YH感染293A细胞后吸附猪红细胞的能力进行鉴定,结果显示,Ad5-CD2vUb-YH表达的CD2v蛋白具有吸附红细胞的特性。本研究首次获得了一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH,其表达的CD2v蛋白与ASFV的CD2v蛋白特性完全一致,为ASFV CD2v蛋白吸附红细胞功能域的研究和ASFV重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 腺病毒载体 CD2v蛋白
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非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：3
3
作者 杨莎莎 苗雨润 +8 位作者 薄宗义 王振忠 谭凯 鲍晨沂 吴晓东 陈鸿军 郑龙三 钱莺娟 戴建君 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期976-981,共6页
p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Ro... p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Rosetta后,经IPTG诱导表达和镍柱纯化;将纯化后的重组p30蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合和间接ELISA方法,筛选出了2株能够稳定分泌抗p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,并通过制备腹水的方法获得单克隆抗体;最后经Western-blot和IFA试验鉴定,其均能与ASFV感染细胞发生特异性反应。本研究为ASFV感染的诊断和致病机制研究提供了重要材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒pp62蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：2
4
作者 储珺 赵普 +7 位作者 张婕妮 王振忠 苗雨润 鲍晨沂 郑龙三 吴晓东 钱莺娟 戴建君 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期579-585,共7页
pp62蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)CP530R基因编码的多聚蛋白前体,可被蛋白水解酶切割形成成熟蛋白p35、p15和p8,与pp220多聚蛋白前体的加工产物组装成病毒核壳。本研究参考ASFV China/2018/AnhuiXCGQ毒株基因序列,分析后选取CP530R基因N端(... pp62蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)CP530R基因编码的多聚蛋白前体,可被蛋白水解酶切割形成成熟蛋白p35、p15和p8,与pp220多聚蛋白前体的加工产物组装成病毒核壳。本研究参考ASFV China/2018/AnhuiXCGQ毒株基因序列,分析后选取CP530R基因N端(1—612 bp)及C端(784—1593 bp),分别构建原核表达质粒pET-28a-pp62-N和pET-28a-pp62-C;转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达pp62蛋白;再用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和阳性克隆筛选后,获得4株可稳定分泌pp62单克隆抗体的杂交瘤细胞。Western-blot检测ASFV感染PAM细胞中pp62剪切体的结果显示,1株仅识别pp62蛋白,1株仅识别p35蛋白,1株仅识别p15蛋白,1株可识别pp62和p8蛋白。IFA鉴定结果显示,4株均能与ASFV感染PAM细胞产生特异性绿色荧光。本研究为建立ASFV诊断方法和研究pp62的生物学功能奠定了生物材料基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pp62蛋白 单克隆抗体
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