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宿主细胞erp57基因敲除抑制流感病毒复制的研究 被引量：1
1
作者 胡丹 王斌 +4 位作者 冷有龙 王玉杰 于群 郑永辉 范春玲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期429-433,共5页
ERp57是细胞内质网内的蛋白二硫键异构酶家族成员,可以催化蛋白二硫键的合成以促进蛋白折叠。为研究erp57基因敲除对流感病毒复制的影响,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了erp57基因的向导RNA(g RNA)敲除质粒p GEM-erp57g RNA,并将其与p ... ERp57是细胞内质网内的蛋白二硫键异构酶家族成员,可以催化蛋白二硫键的合成以促进蛋白折叠。为研究erp57基因敲除对流感病毒复制的影响,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了erp57基因的向导RNA(g RNA)敲除质粒p GEM-erp57g RNA,并将其与p Cas9-EGFP共转染至人肺腺癌细胞A549中,采用流式分选及限制性稀释的方法筛选单细胞克隆株,通过靶基因组测序及western blot检测,筛选获得了erp57基因敲除的A549细胞系。erp57基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。此外,将H1N1亚型流感病毒分别感染野生型和erp57基因敲除细胞系以测定erp57基因敲除对流感病毒复制水平的影响。结果显示流感病毒在erp57基因敲除细胞中的复制显著地受到了抑制,表明ERp57是流感病毒复制过程中的一个关键蛋白。本研究为开发新的抗流感病毒手段提供了相关的实验依据。 展开更多
关键词 erp57 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 流感病毒
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基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系 被引量：3
2
作者 徐广军 曹世诺 +3 位作者 郑君 张险峰 贾洪林 郑永辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期45-49,共5页
由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以... 由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以本实验室构建的含有单链引导RNA(sgRNA)骨架转录序列的通用质粒(p Gen-sgRNA)为模板,将U6启动子与合成的相关基因gRNA靶序列经PCR融合扩增,其产物再与sgRNA的骨架转录序列进行重叠延伸PCR扩增,并将扩增产物克隆于p GEM-T载体中,分别构建了具有靶向不同目的基因ORF的gRNA重组质粒。将这些重组质粒分别与pMJ920质粒共转染于MDCK细胞中,通过G418筛选和流式细胞仪分选,并以终点稀释法纯化培养筛选出的单细胞克隆株。经gRNA靶序列片段的测序鉴定,获得了目的基因敲除的MDCK细胞系,并分别命名为MDCK-IRGM4-、MDCK-IRGM5-和MDCKIRGM6-。通过western blot检测经γ干扰素诱导条件下的这3种IRGMs基因在敲除细胞系中相应的蛋白表达均为阴性。这3种MDCK细胞IRGMs敲除的细胞系的建立,为进一步研究IRGMs基因在抗细胞内病原微生物感染中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 MDCK IRGM4 IRGM5 IRGM6
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HIV-1 Nef蛋白最新功能及其增强病毒感染性分子机理的研究进展 被引量：2
3
作者 时静 张险峰 郑永辉 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期113-120,共8页
Nef蛋白是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）及其他灵长类动物慢病毒编码的一种附属蛋白,在获得性免疫缺陷综合症（AIDS）疾病进程和病毒的复制过程中起着重要作用。抑制附属蛋白活性的策略可以改善传统抗逆转录病毒方案的疗效,因此深入理... Nef蛋白是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）及其他灵长类动物慢病毒编码的一种附属蛋白,在获得性免疫缺陷综合症（AIDS）疾病进程和病毒的复制过程中起着重要作用。抑制附属蛋白活性的策略可以改善传统抗逆转录病毒方案的疗效,因此深入理解这一附属蛋白的功能和其分子作用机制具有重要意义。Nef蛋白通过三个主要活性调节宿主细胞环境,增强病毒复制。下调细胞表面分子如CD4,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ等的表达,使病毒逃逸宿主的免疫应答;通过调节T细胞的信号通路降低T细胞的活化,从而营造有利于病毒复制的环境;直接增强新生子代病毒粒子的感染性。这一功能的分子机制直到最近宿主限制性因子丝氨酸转运蛋白（SERINC5）的发现才得以明晰。本文总结了Nef的功能及其增强病毒感染性的最新研究进展,同时也归纳了SERINC5蛋白与Nef蛋白的相互作用的研究报道,为深入了解病毒复制机理,改善HIV-1防治方案提供新的理论线索。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1) NEF SERINC5 感染性
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自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究
4
作者 刘鑫 王斌 +2 位作者 姚晓雨 郑永辉 范春玲 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期888-894,共7页
自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研... 自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P<0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。 展开更多
关键词 自噬(Autophagy) 自噬相关基因3(Atg3) 埃博拉病毒(EBOV) 囊膜蛋白(GP)
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