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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定
1
作者 林维鹏 崔鹏飞 +2 位作者 王思文 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期107-112,139,共7页
A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。 展开更多
关键词 A型流感病毒 PB2蛋白 帽子结合结构域 原核表达 纯化
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一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估 被引量：1
2
作者 张奕杰 孟飞 +3 位作者 杨焕良 宋祖晨 陈艳 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期987-993,共7页
本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列... 本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%~100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1(EA H1N1)SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋白头部区域未缺失,表明该病毒对奥司他韦类药物敏感;PA蛋白^(356)R为病毒复制增强和对哺乳动物致病性增强的分子特征;NP蛋白存在^(41)I以及^(210)E病毒聚合酶活性增强的分子特征;M2蛋白的^(31)N表示该SIV对金刚烷胺类药物耐药。将该病毒以10^(6) EID_(50)/只经鼻腔感染2只雪貂,感染后96 h剖杀,采集各脏器组织观察其剖检病变并对出现病变的肺脏制备病理切片观察其组织病变,采用免疫组化试验检测肺脏组织中的病毒抗原。将采集的所有脏器处理后接种鸡胚检测脏器内的病毒滴度评估该病毒在雪貂体内的复制能力;将该株病毒以上述剂量经鼻腔感染3只雪貂分别放入3个铁笼内作为感染组,24 h后在相邻3个铁笼内分别放入1只未感染雪貂作为传播组。所有雪貂自感染组接种病毒后2 d起,隔天采集鼻洗液至第14 d,通过检测雪貂鼻洗液内� 展开更多
关键词 猪流感病毒 欧亚类禽H1N1 遗传演化 飞沫传播
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一株欧亚类禽H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析及其对小鼠的致病力研究
3
作者 刘雅茹 宋祖晨 +5 位作者 孟飞 黄凯伦 王飞飞 陈艳 陈化兰 杨焕良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期553-558,共6页
猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特... 猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特征和其对小鼠的致病性,本研究利用鸡胚对病毒纯化传代后,采用Reed-Muench方法测定SIV SW/SD/260/2021株EID50、TCID50,对其全基因组测序并分析其同源性。采用MEGA7.0中的邻接法构建HA和NA基因的进化树。进一步将该SIV以106 EID50/只滴鼻感染小鼠,于感染后3 d剖杀各组小鼠,采集各脏器组织,检测其体内病毒的复制情况,剩余小鼠在14 d内观察临床症状、记录体质量等,评价该SIV对哺乳动物的致病性。结果显示,该病毒株经纯化后EID50为107.25/0.1 mL,TCID50为105.67/0.1 mL;全基因组序列的BLAST比对结果显示,该病毒株的8个节段与来自辽宁、天津、Oman(阿曼苏丹)、江苏等多地不同年份的H1N1猪或人流感病毒高度同源。小鼠致病性试验结果显示,该病毒在小鼠的鼻甲和肺中呈高水平复制,病毒滴度均达104 EID50以上;感染组小鼠出现精神沉郁、被毛凌乱、食欲减退、体质量快速下降等症状,并于感染后第4 d全部死亡。本研究对欧亚类禽H1N1亚型SIV的序列进行分析,阐明了该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性,并揭示了欧亚类禽H1N1亚型SIV的跨种传播风险,为我国SIV的监测和SI的防控提供参考依据。 展开更多
关键词 猪流感病毒 H1N1 进化分析 致病力
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一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究
4
作者 白晓利 李明慧 +4 位作者 田井满 宋兴栋 刘丽娜 李雁冰 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期445-451,共7页
2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,... 2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF,符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支,外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年~2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高,且处于同一分支;PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高,为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高,且处于同一分支,推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示,该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制,但其在A549中的复制效率高于其在MDCK及293T细胞中的复制效率。BALB/c小鼠感染实验结果显示,该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,对小鼠的半数致死量(MLD50)为0.98log10EID50,对小鼠呈高致病性。本研究结果对H5亚型HPAI的综合防控和公共安全预警具有借鉴意义。 展开更多
关键词 H5N8 高致病性禽流感 遗传演化分析 抗原性分析 哺乳动物致病性
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