一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究 被引量：16

1

作者 唐续 杨焕良 +8 位作者 鄢明华 李秀丽 陈艳 孟沙沙 尹航 辛晓光 步志高 乔传玲 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期270-273,336,共5页

为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测... 为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。 展开更多

关键词 猪流感病毒 人源H1N1亚型 遗传演化分析 抗原性分析 致病性

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不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究 被引量：7

2

作者 陶启蒙 王秀荣 +4 位作者 武嘉男 石霖 李雁冰 包红梅 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期954-958,共5页

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T/A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因... 本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T/A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT-PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100%和96%。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。 展开更多

关键词 不对称PCR 基因芯片 禽病 禽流感亚型 鉴别

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甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：7

3

作者 尹航 杨焕良 +5 位作者 陈艳 孟沙沙 刘丽萍 辛晓光 陈化兰 乔传玲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期36-39,共4页

为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用... 为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。 展开更多

关键词 猪流感病毒 H1N1亚型 TAQMAN MGB探针 实时荧光定量PCR

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AA肉鸡免疫禽流感油乳剂灭活疫苗细胞免疫应答的变化 被引量：5

4

作者 王彦妮 曾显营 +2 位作者 田国彬 苏文 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期141-145,共5页

为了解肉鸡生长期内免疫前后的细胞免疫反应,本实验采用CD3/CD4/CD8三色流式细胞术、MTT法和Griess法依次检测了AA肉鸡免疫禽流感灭活疫苗和非免疫状态下外周血、胸腺和脾脏中T淋巴细胞及其亚群的相对含量、外周血中T淋巴细胞对PHA-P的... 为了解肉鸡生长期内免疫前后的细胞免疫反应,本实验采用CD3/CD4/CD8三色流式细胞术、MTT法和Griess法依次检测了AA肉鸡免疫禽流感灭活疫苗和非免疫状态下外周血、胸腺和脾脏中T淋巴细胞及其亚群的相对含量、外周血中T淋巴细胞对PHA-P的增殖反应能力和诱导巨噬细胞NO分泌量的变化。结果表明,非免疫状态下,AA肉鸡外周血CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞相对百分含量在7日龄时均为最低,脾脏中CD4+T淋巴细胞相对百分含量在整个试验期一直呈下降趋势,免疫后外周血、脾脏和胸腺中CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞相对百分含量均明显高于非免疫组,且脾脏CD4+T淋巴细胞呈阶段性上升状态;各时期淋巴细胞刺激指数(SI)值和巨噬细胞NO分泌量检测结果表明,免疫组均高于同期对照组(p<0.05)。研究结果还表明:肉鸡在7日龄时细胞免疫水平最低,灭活疫苗可以激发肉鸡产生较强的细胞免疫应答。 展开更多

关键词 灭活疫苗 T淋巴细胞亚群 AA肉鸡 MTT法 Griess法

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4种禽病毒抗体可视化蛋白芯片的制备及应用 被引量：8

5

作者 石霖 王秀荣 +6 位作者 杨忠苹 陶启蒙 蔡冬冬 武嘉男 王馥梅 田国彬 陈化兰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期1413-1420,共8页

【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再... 【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300μg·ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传统抗体检测方法同时检测18份现地样品,结果发现可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且灵敏性明显高于传统检测手段。【结论】研究表明该方法可用于同步鉴别4种禽病抗体,是一种有效的抗体检测新方法。 展开更多

关键词 可视化 蛋白芯片 禽病 鉴别

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区分禽流感病毒亚型诊断基因芯片的构建 被引量：7

6

作者 杨忠苹 王秀荣 +4 位作者 石霖 田丽娜 王煜 陶启蒙 陈化兰 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2008年第10期29-32,共4页

制备了可同时区分AIVH5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片。试验以重组质粒为模板,进行PCR扩增,然后用异丙醇沉淀法进行纯化,制备探针及内参基因。将探针及内参基因用点样缓冲液稀释到0.3μg/μL后用芯片点样仪... 制备了可同时区分AIVH5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片。试验以重组质粒为模板,进行PCR扩增,然后用异丙醇沉淀法进行纯化,制备探针及内参基因。将探针及内参基因用点样缓冲液稀释到0.3μg/μL后用芯片点样仪将其点制到醛基化基片上,样点中心间距450μm,样点直径220μm。将点好的基片在室温干燥24h以上,后经65℃再水合10s、80℃干燥、65mj紫外线交联照射25min后,再用封闭液封闭,95℃变性处理,成功构建了能区分禽流感血凝素H5,H7,H9亚型及神经氨酸酶N1,N2亚型的检测基因芯片。在PCR扩增中标记待检样品,对制备的检测芯片进行质量检验,结果表明,制备的区分禽流感病毒亚型基因芯片可区分AIV部分亚型。 展开更多

关键词 禽流感 基因芯片 亚型鉴别

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利用基因芯片技术区分禽流感病毒主要亚型 被引量：4

7

作者 杨忠苹 王秀荣 +2 位作者 田丽娜 王煜 陈化兰 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期935-940,共6页

【目的】研制可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片。【方法】分别克隆了禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因以及看家基因GAPDH的重组质粒。以重组质粒为模板,用PCR方法扩... 【目的】研制可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片。【方法】分别克隆了禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因以及看家基因GAPDH的重组质粒。以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的片基上,制备基因芯片。在PCR过程中对待检样品进行标记,然后与芯片杂交,洗涤,扫描并进行结果分析。【结果】结果显示检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。同时用RT-PCR、鸡胚接种和基因芯片方法对H1-H15亚型AIV参考毒株、30份人工感染样品、21份现地疑似样品进行检测,结果发现,对人工感染样品芯片检测方法与鸡胚接种和RT-PCR的符合率分别为100%和96%,现地样品符合率为100%。【结论】研究表明该方法可用于同步鉴别部分主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。 展开更多

关键词 基因芯片 禽流感 亚型区分

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蛋白质组学主要实验技术的研究进展 被引量：1

8

作者 蔡冬冬 王秀荣 +5 位作者 石霖 武嘉男 陶乐蒙 王馥梅 包红梅 陈化兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期680-683,共4页

关键词 蛋白质组学 实验技术 人类基因组计划 后基因组时代 相对稳定性 基因组编码 生命现象 基因数量

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不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响 被引量：2

9

作者 石文军 曾显营 +4 位作者 臧金凯 吴姣姣 白洁 陈化兰 田国彬 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期301-305,共5页

为了解不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响,本研究选取禽流感病毒(AIV)CK/Hu N/174/08和CK/Hu B/S4196/09株制备成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后采血检测血凝抑制(HI)抗体,免疫后3周时分别采用这两株亲本病毒经鼻腔途... 为了解不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响,本研究选取禽流感病毒(AIV)CK/Hu N/174/08和CK/Hu B/S4196/09株制备成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后采血检测血凝抑制(HI)抗体,免疫后3周时分别采用这两株亲本病毒经鼻腔途径攻毒。HI抗体测定结果显示:两株疫苗免疫21 d时,平均HI抗体滴度均可达10 log2以上,表明这两株病毒均具有良好的免疫原性。测定每0.1 mL CK/Hu N/174/08株病毒EID_(50)和CID_(50)分别为10^(-9.25)和10^(-3.88),CK/Hu B/S4196/09株为10^(-8.68)和10^(-5.38)。分别以10~6 EID_(50)、10 CID_(50)及10~2 CID_(50)剂量攻毒,CK/Hu N/174/08株和CK/Hu B/S4196/09株疫苗对亲本病毒株攻击的保护率分别为100%和0、100%和80%与60%和0,表明依据EID_(50)和CID_(50)攻毒,CK/Hu N/174/08株疫苗可以得出免疫保护效果一致的结论,而CK/Hu B/S4196/09株疫苗免疫保护效果不一致。本研究表明,EID_(50)和CID_(50)均可以作为H9亚型禽流感疫苗攻毒剂量的参考依据,但以CID_(50)为依据更可靠;10 CID_(50)是最佳的攻毒剂量。本研究为科学评价H9亚型禽流感疫苗的攻毒保护效果提供了依据,对于研制疫苗时选择种毒株以及临床上选用有效疫苗均具有指导意义。 展开更多

关键词 攻毒剂量 H9亚型禽流感疫苗 免疫效果 评估

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流感病毒抗原表位的研究进展 被引量：1

10

作者 孙晓东 熊永忠 +1 位作者 陈化兰 王秀荣 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第6期193-196,共4页

流感病毒抗原表位的研究,不仅是对流感病毒致病机理和机体免疫系统反应的探究,还能很好地指导对流感的防治。作者从抗原表位的特点,流感病毒抗原表位的特点、研究进展及流感病毒抗原表位疫苗的应用几个方面进行了综述。

关键词 流感病毒 抗原表位 表位疫苗

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禽网状内皮组织增殖病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响 被引量：1

11

作者 白洁 曾显营 +4 位作者 祁小乐 李鑫 李倩倩 陈化兰 田国彬 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期291-294,共4页

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄... 为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄两次免疫r LH5-6疫苗,并设未感染REV的免疫对照组,于免疫后检测血清HI抗体,并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染REV后HI抗体滴度均低于相应的未感染REV的免疫对照组。感染REV后,免疫一次Re-6灭活疫苗、r LH5-6活疫苗及两次r LH5-6活疫苗的实验鸡攻毒后的存活率分别为70%、60%及80%,排毒鸡数分别为4/10、4/10及3/10;未感染REV的免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照组实验鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,REV对AIV灭活疫苗和活疫苗均具有明显的免疫抑制作用,加强免疫r LH5-6疫苗可以部分减轻该抑制作用。 展开更多

关键词 禽网状内皮组织增殖病病毒 禽流感疫苗 免疫效果 影响

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重组SEA增强H5亚型禽流感灭活疫苗对肉鸡的免疫效果研究 被引量：1

12

作者 苏文 曾显营 +4 位作者 田国彬 杨婧 张盼涛 王彦妮 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期393-396,共4页

为评价重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)对H5亚型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以原核表达的rSEA为免疫增强剂,制备成含有rSEA高(167μg/0.5 mL)、低(16.7μg/0.5 mL)两种剂量的AIV油乳剂灭活苗,分别免疫7 d龄肉鸡,通过检测... 为评价重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)对H5亚型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以原核表达的rSEA为免疫增强剂,制备成含有rSEA高(167μg/0.5 mL)、低(16.7μg/0.5 mL)两种剂量的AIV油乳剂灭活苗,分别免疫7 d龄肉鸡,通过检测免疫鸡AIV HI抗体滴度及外周血CD4+/CD8+值评价其免疫效果。HI抗体检测结果显示,免疫后2周高剂量组HI抗体平均滴度为5.6 log2,低剂量组为4.2 log2,而无rSEA疫苗对照组为2.9 log2(p<0.01);同时在免疫后前4周,rSEA免疫组的HI抗体平均滴度及峰值与对照组相比均差异显著(p<0.05)。T淋巴细胞亚群检测结果显示,肉鸡免疫高剂量rSEA的灭活苗后,其外周血CD4+百分含量及CD4+/CD8+值均显著高于对照组(p<0.05)。上述结果表明,rSEA作为AIV灭活苗免疫增强剂,能够快速诱导较高的HI抗体滴度,同时也可增强细胞免疫反应,有效缩短免疫空白期,使肉鸡短时间内产生较强的免疫应答反应。 展开更多

关键词 禽流感灭活疫苗 rSEA 免疫增强剂 肉鸡

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猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01分离株神经氨酸酶基因的克隆及真核表达 被引量：3

13

作者 赵朴 李海燕 +3 位作者 杨焕良 陈化兰 于康震 卢中华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期1-4,共4页

根据GenBank中登录的猪流感病毒参照序列设计了扩增神经氨酸酶 (NA)基因的特异性引物。从猪流感病毒A/Swine/InnerMongolia/5 4 7/0 1(H3N2 )株感染的鸡胚液中直接提取病毒RNA ,经RT_PCR扩增后将其克隆到pMD18_T载体上 ,进行序列测定和... 根据GenBank中登录的猪流感病毒参照序列设计了扩增神经氨酸酶 (NA)基因的特异性引物。从猪流感病毒A/Swine/InnerMongolia/5 4 7/0 1(H3N2 )株感染的鸡胚液中直接提取病毒RNA ,经RT_PCR扩增后将其克隆到pMD18_T载体上 ,进行序列测定和拼接。用HindⅢ酶切后 ,亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,得到重组转移载体pMelBacNA ,然后与线性化杆状病毒DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染于sf9昆虫细胞。经 3轮噬斑纯化 ,提取其DNA经PCR鉴定 ,获得重组杆状病毒株。SDS_PAGE结果显示 ,目的基因已获得表达 ,Westernblot和神经氨酸酶活性检测结果显示表达产物具有良好的免疫原性和神经氨酸酶活性 。 展开更多

关键词 猪流感病毒 神经氨酸酶 基因克隆 基因表达 流感

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