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广东屠猪肉样品中大肠杆菌耐药性与毒力特征的分析 被引量：12
1
作者 孙迎 廖晓萍 +7 位作者 王秀梅 孙坚 刘宝涛 朱恒乾 张悦 王杨 张美君 刘雅红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期32-36,共5页
为分析广东地区屠猪肉中大肠杆菌(E.coli)药物敏感菌株的血清型、毒力基因和系统进化背景,本研究从屠猪肉样品中分离出112株E.coli,采用玻片凝集法鉴定血清型,琼脂稀释法测定10种抗菌药的敏感性,PCR方法检测7种毒力相关基因,多重PCR方... 为分析广东地区屠猪肉中大肠杆菌(E.coli)药物敏感菌株的血清型、毒力基因和系统进化背景,本研究从屠猪肉样品中分离出112株E.coli,采用玻片凝集法鉴定血清型,琼脂稀释法测定10种抗菌药的敏感性,PCR方法检测7种毒力相关基因,多重PCR方法进行系统进化背景判定。结果显示,112株E.coli中,定型菌株95株,分别属于15种血清型,其中O65、O131、O8和O158为优势血清型。几乎所有菌株对氟苯尼考、多西环素和四环素高度耐药,而对头孢曲松高度敏感,其中多重耐药菌株多数耐5种以上药物,常见的多重耐药表型是氟苯尼考/氯霉素/多西环素/四环素/氨苄西林。PCR鉴定结果表明,含有毒力基因的菌株中38%至少具有两个毒力基因,其中EAST1+Stx2e和hlyF+Stx2e比较常见。比较常见的毒力基因为Stx2e和EAST1,STb基因仅在一株菌中检测到。多重PCR鉴定结果显示,屠猪肉样品中E.coli主要分布为共生型的A组和B1组。本研究为大肠杆菌病的控制和合理使用抗生素提供实验依据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 耐药性 血清型 毒力基因
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副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析 被引量：8
2
作者 李建军 胡明明 +4 位作者 朱晓凯 李艳玲 张艳禾 谢芳 王春来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期238-240,共3页
为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和... 为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约106 ku,并以包涵体形式存在。表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清抗体效价在1∶3 200以上,表明TbpA具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 tbpA基因 原核表达
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副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素CdtC亚基的克隆表达及细胞毒性分析 被引量：2
3
作者 李艳玲 李建军 +6 位作者 周泷 崔宁 刘娇 张艳禾 李刚 谢芳 王春来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期449-452,共4页
细胞致死膨胀毒素(CDT)由CdtA、CdtB和CdtC三个亚基构成,是细菌的一种重要毒力因子。为研究副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT的CdtC亚基的功能,本研究根据G enBank中cdtC基因序列设计引物,扩增cdtC基因,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中进... 细胞致死膨胀毒素(CDT)由CdtA、CdtB和CdtC三个亚基构成,是细菌的一种重要毒力因子。为研究副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT的CdtC亚基的功能,本研究根据G enBank中cdtC基因序列设计引物,扩增cdtC基因,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中进行诱导表达。SD S-PAGE和w estern blot检测目的蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为25 ku。将纯化后的重组蛋白复性后进行体外细胞毒性试验。结果表明,CdtC蛋白对Vero细胞和PK-15细胞有较强的细胞毒性作用。本研究为研究细胞致死膨胀毒素CDT的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 CdtC亚基 细胞毒性
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牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大肠杆菌中的过表达,纯化及抑菌活性 被引量：9
4
作者 赵昆 刘思国 +9 位作者 王春来 宫强 迟磊 刘建东 王勇 云孟克 常月红 刘慧芳 周媛媛 孙延鸣 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期65-70,共6页
牛抗菌肽Bac7和Bac5是一种线性阳离子小分子多肽,在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组... 牛抗菌肽Bac7和Bac5是一种线性阳离子小分子多肽,在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于E.coli BL21(DE3)中实现了重组蛋白B7-B5(rB7-B5)的过表达,表达的rB7-B5以包涵体形式存在,rB7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6%,分子量大小为33kDa,与预测大小相符。以8mol/L尿素变性包含体后用Ni亲和层析柱纯化目的蛋白,经多步透析法复性的rB7-B5对猪胸膜肺炎放线杆菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性,为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。 展开更多
关键词 牛抗菌肽Bac7和Bac5 融合基因 重组表达 抑菌活性
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胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选 被引量：5
5
作者 刘慧芳 刘思国 +5 位作者 王春来 司微 王聃 杜艳芬 赵海玲 赫明雷 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期847-850,共4页
利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后... 利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后血清D150nm分别由原来的0．927和0．239降低为0．196和0．078。同时,将APP1基因组DNA以Bsp143I进行酶切，回收500～2000bp的片段，与pET30a／b／c载体连接，构建了APP1基因组质粒表达文库，库容量（CFU）为2．0×10^5。用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库，从3000个菌落中获得了12个阳性克隆。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 体内诱导抗原技术 菌落原位免疫杂交
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牛霉形体PCR检测方法的建立 被引量：7
6
作者 李媛 董惠 +5 位作者 张美晶 陈超 曹培丽 郭丹 姜海芳 辛九庆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期416-420,共5页
参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法,并对该方法进行了敏感性和特异性试验。该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体... 参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法,并对该方法进行了敏感性和特异性试验。该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(M.agalactiae)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性。利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法。 展开更多
关键词 牛霉形体 牛传染性胸膜肺炎 聚合酶链式反应
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结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析 被引量：6
7
作者 王华南 亓英芳 +10 位作者 朱婷 于申业 刘慧芳 司微 杨盛 王加明 冯拥军 李素兰 于秀婷 王春来 刘思国 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期697-700,共4页
以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋... 以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 pdhA基因 原核表达
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禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达 被引量：4
8
作者 迟磊 刘思国 +7 位作者 王春来 宫强 赵昆 刘建东 王勇 云孟克 刘慧芳 赵福广 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期856-859,共4页
以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重... 以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明,表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA。 展开更多
关键词 禽分枝杆菌副结核亚种 map0862基因 map2154c基因 重叠延伸剪接技术 重组表达
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信号标签诱导技术的研究进展 被引量：3
9
作者 赫明雷 刘思国 《畜牧兽医科技信息》 2008年第9期5-7,共3页
Signature-tagged mutagenesis(STM)信号标签突变技术是一种有效的负向选择方法,主要用来鉴定能使病原体在宿主体内成功存活和复制的决定性基因。问世十几年以来,STM技术已经应用于31种细菌中,筛选了大量的转座插入突变体,有大约1700多... Signature-tagged mutagenesis(STM)信号标签突变技术是一种有效的负向选择方法,主要用来鉴定能使病原体在宿主体内成功存活和复制的决定性基因。问世十几年以来,STM技术已经应用于31种细菌中,筛选了大量的转座插入突变体,有大约1700多种细菌的基因得到认识和鉴定,包括毒力因子。由于在信号标签和鉴定方法的改进,使得STM技术有了很大发展,增加其多样性和灵活性,扩大了其应用范围。本文就STM技术中关键步骤的改进进行综述。 展开更多
关键词 信号标签诱导 转座突变 负向筛选体系
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猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析 被引量：4
10
作者 张美晶 王亮 +6 位作者 李媛 董慧 姜海芳 陈超 曹培丽 郭丹 辛九庆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期150-157,共8页
以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最... 以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 单克隆抗体 抗原表位 肽扫描 生长抑制试验
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牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果 被引量：3
11
作者 宫强 刘思国 +5 位作者 王春来 刘慧芳 刘建东 施远祥 阿曼古丽 孔宪刚 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期134-138,共5页
利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗。以牛分枝杆菌... 利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗。以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况。结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05)。二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05)。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 融合DNA疫苗 组合DNA疫苗
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牛分枝杆菌三价组合及融合DNA疫苗免疫效果的研究 被引量：3
12
作者 宫强 刘思国 +7 位作者 王春来 王勇 刘建东 刘慧芳 施远祥 阿曼古丽 李发斌 孔宪刚 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期466-471,共6页
分泌性蛋白Ag85B、MPB64和ESAT-6为Mycobacterium bovis的主要保护性抗原,在诱导机体免疫反应和抵抗感染中发挥重要作用。本研究以pcDNA3.1(+)为载体,构建了由上述3种抗原基因构成的不同疫苗:3基因融合(pcDNA-MPB64-Ag85B-ESAT-6,pCMAE)... 分泌性蛋白Ag85B、MPB64和ESAT-6为Mycobacterium bovis的主要保护性抗原,在诱导机体免疫反应和抵抗感染中发挥重要作用。本研究以pcDNA3.1(+)为载体,构建了由上述3种抗原基因构成的不同疫苗:3基因融合(pcDNA-MPB64-Ag85B-ESAT-6,pCMAE)DNA疫苗和三价(pcDNA-Ag85B+pcDNA-MPB64+pcDNA-ESAT-6)DNA疫苗,评价各种DNA疫苗诱导的体液免疫、细胞免疫及以BCG攻毒后的免疫保护水平。试验结果表明,多基因融合DNA疫苗免疫后的小鼠血清抗体水平、淋巴细胞增殖(SI值)、gamma interferon(IFN-γ)和interleukin-2(IL-2)水平明显高于其他各组(P<0.05),攻毒保护效果也优于多价DNA疫苗,达到了BCG疫苗的免疫保护水平,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 融合DNA疫苗 多价DNA疫苗
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牛分枝杆菌单基因及双价融合基因DNA疫苗免疫效果的研究 被引量：2
13
作者 宫强 刘思国 +8 位作者 王春来 王勇 刘建东 迟磊 赵昆 周媛媛 常月红 云孟克 孔宪刚 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期47-52,共6页
利用PCR技术和SOE技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6和mpb64-esat-6融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCA、pCE6、pCH、pCM、pCAE、pCHE和pCME。转染SP2/0细胞,检测目... 利用PCR技术和SOE技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6和mpb64-esat-6融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCA、pCE6、pCH、pCM、pCAE、pCHE和pCME。转染SP2/0细胞,检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠后检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN～γ分泌情况。结果表明,7种重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著(P<0.05),其中pCA组血清抗体水平明显高于其他6种DNA疫苗免疫组(P<0.05);三免两周后,融合基因免疫组的刺激值(SI值)与单基因免疫组相比差异显著(P<0.05),其中以pCME组的SI值最高;PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN～γ高于单基因DNA疫苗组(P<0.05),而两对照组则未检测到IFN～γ的产生。成功构建了牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64单基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6双价融合基因DNA疫苗,从而为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 单基因 融合基因 DNA疫苗
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副结核分枝杆菌MAP1588C蛋白的原核表达与抗原性分析 被引量：2
14
作者 刘银冰 陈利苹 +2 位作者 鄢秋龙 曹俊 刘思国 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第6期36-39,共4页
从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的... 从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的Western blot验证了纯化蛋白产物;另外,副结核阳性牛血清可检测到该蛋白条带。结果表明,表达的重组蛋白MAP1588C的蛋白分子量为21 kDa,具有良好抗原性,有望将此抗原用于建立副结核的ELISA诊断方法。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 MAP1588C蛋白 重组表达 免疫性
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猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性 被引量：1
15
作者 曹培丽 李媛 +4 位作者 陈超 郭丹 王亮 乔祖建 辛九庆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期712-717,共6页
为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-29... 为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。 展开更多
关键词 猪肺炎霉形体 p52基因 重组腺病毒 免疫应答
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牛结核病疫苗研究现状 被引量：1
16
作者 宫强 刘思国 《畜牧兽医科技信息》 2008年第8期7-9,共3页
牛结核病是一种严重的人畜共患病，其传染流行严重地影响到畜牧业的持续健康发展，不仅造成奶牛乳房炎、结核性胸膜炎等疾病，还会引起奶牛产乳率和乳质下降，更严重威胁着人类的身心健康。据统计，人结核病有10％以上是由牛分枝杆菌引... 牛结核病是一种严重的人畜共患病，其传染流行严重地影响到畜牧业的持续健康发展，不仅造成奶牛乳房炎、结核性胸膜炎等疾病，还会引起奶牛产乳率和乳质下降，更严重威胁着人类的身心健康。据统计，人结核病有10％以上是由牛分枝杆菌引起，因此控制牛结核病具有重大的公共卫生学意义。 展开更多
关键词 牛结核病 奶牛乳房炎 疫苗 持续健康发展 人畜共患病 牛分枝杆菌 公共卫生学 身心健康
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牛结核病DNA疫苗研究现状 被引量：1
17
作者 宫强 刘思国 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期191-193,共3页
关键词 DNA疫苗 牛结核病 奶牛乳房炎 结核性胸膜炎 预防控制 人畜共患病 牛分枝杆菌 卫生学意义
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结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备 被引量：1
18
作者 崔莹莹 宋宁宁 +4 位作者 党光辉 曹俊 李华芳 于申业 刘思国 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期172-176,共5页
以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋... 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 rv3295基因 原核表达 单克隆抗体
原文传递
结核分枝杆菌rv3668c基因的原核表达及多抗制备 被引量：1
19
作者 鄢秋龙 陈利苹 +3 位作者 刘银冰 曹俊 倪宏波 刘思国 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期594-598,共5页
以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3668c基因,将其连接于表达载体pET-30a(+),获得重组质粒p30a-68,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白His-Rv3668c。用Ni-NTA His-Bind Resin... 以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3668c基因,将其连接于表达载体pET-30a(+),获得重组质粒p30a-68,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白His-Rv3668c。用Ni-NTA His-Bind Resin亲和层析树脂纯化目的蛋白,利用抗6His标签抗体验证蛋白的纯化结果;通过Western-blot分析纯化蛋白与牛结核病阳性血清的反应情况。用重组蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA序列测定均完全正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,His-Rv3668c以可溶形式表达,蛋白质分子质量为26ku;纯化的蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应,表明其具有很好的免疫原性。所制备的多克隆抗体也具有良好的特异性,可运用于对Rv3668c蛋白的功能特性研究。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 rv3668c基因 原核表达 免疫原性
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利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究 被引量：1
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作者 司微 刘慧芳 +9 位作者 王春来 彭玮 赫明雷 杜艳芬 赵海玲 王聃 杨金国 林靖凯 倪洪波 刘思国 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第8期28-30,共3页
为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒p... 为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。 展开更多
关键词 RED重组系统 ClpP基因 基因敲除
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