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结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备 被引量：10
1
作者 唐宇龙 刘湘新 +2 位作者 杨华 丁元生 胡忠义 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期811-814,共4页
以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经... 以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔,收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示,成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒,获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白,以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 融合蛋白CFP10-ESAT-6 表达 多克隆抗体
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互花米草内生真菌Fusarium sp.F4中的活性代谢物 被引量：11
2
作者 邵志宇 冯永红 +2 位作者 邓云霞 徐德强 洪枫 《中国天然药物》 SCIE CAS CSCD 2007年第2期108-111,共4页
目的:研究海草Spartina alterniflora中内生真菌Fusarium sp.F4中的活性代谢物。方法:经硅胶、Sephadex LH-20反复柱层析分离纯化并通过波谱分析鉴定了6个化合物。结果:6个化合物分别被鉴定为麦角甾醇(Ⅰ)、过氧化麦角甾醇(Ⅱ)、白僵菌... 目的:研究海草Spartina alterniflora中内生真菌Fusarium sp.F4中的活性代谢物。方法:经硅胶、Sephadex LH-20反复柱层析分离纯化并通过波谱分析鉴定了6个化合物。结果:6个化合物分别被鉴定为麦角甾醇(Ⅰ)、过氧化麦角甾醇(Ⅱ)、白僵菌素(Ⅲ),T-2毒素(Ⅳ),ilicicolin H(Ⅴ),alcaligin(Ⅵ)。结论:化合物Ⅴ、Ⅵ为首次从该属真菌中发现。全归属了化合物V的氢谱数据。药理实验表明化合物III对结核分枝杆菌毒株(Mycorbacterium tuberculosis H37RV)有显著抑制。 展开更多
关键词 FUSARIUM sp. 代谢物 药理活性
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三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用 被引量：10
3
作者 唐宇龙 杨华 +5 位作者 刘湘新 柳斌 秦莲花 郑瑞娟 丁元生 胡忠义 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期597-600,共4页
目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT84和MPT63-MPT70重组蛋白抗体,探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63- MPT70免疫血清,制备包被抗体和标记抗体,建立检测3种蛋白的双抗体夹心法,并将其... 目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT84和MPT63-MPT70重组蛋白抗体,探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63- MPT70免疫血清,制备包被抗体和标记抗体,建立检测3种蛋白的双抗体夹心法,并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25 ng/mL,MPT64和MPT63-MPT70均为50 ng/mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液,只有结核分枝杆菌为阳性;而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外,还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33.9%、41.2%和47.9%;检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1.8%、7.1%和10.7%;检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3.1%和7.8%。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高,但特异性较好。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组蛋白质类 ESAT-6-CFP10融合蛋白 MPT64蛋白 结核分枝杆菌 MPT63-MPT70
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SLC11A1基因多态性在新发和复发肺结核患者中的分布 被引量：5
4
作者 刘轾彬 肖和平 +3 位作者 沙巍 郑瑞娟 刘一典 胡忠义 《同济大学学报（医学版）》 CAS 2008年第2期19-23,共5页
目的探讨SLC11A1基因多态性在中国汉族人群新发和复发肺结核患者中的分布。方法在中国汉族人群中,选择新发肺结核患者、复发肺结核患者和健康对照者各30例,应用SNaPshot SNP分型技术检测以上人群SLC11A1基因多态性位点INT4、D543N和3′... 目的探讨SLC11A1基因多态性在中国汉族人群新发和复发肺结核患者中的分布。方法在中国汉族人群中,选择新发肺结核患者、复发肺结核患者和健康对照者各30例,应用SNaPshot SNP分型技术检测以上人群SLC11A1基因多态性位点INT4、D543N和3′UTR的基因型,采用Logistic回归分析和2χ检验进行统计学处理。结果病例组3′UTR位点TGTG+/del基因型频率显著高于对照组(P=0.038),病例组与对照组INT4和D543N位点各基因型频率无显著性差异,病例组D543N和3′UTR位点联合分析显示GG/+del及GA/+del基因型频率均显著高于对照组(P=0.048和P=0.034)。新发肺结核患者与复发肺结核患者3′UTR和D543N/3′UTR基因型频率无显著性差异。结论SLC11A1基因3′UTR位点多态性和D543N/3′UTR单倍体型可能是中国汉族人群肺结核发病的易感因素,但与肺结核复发的关系有待进一步研究。 展开更多
关键词 SLC11A1基因 多态性 结核 肺 复发
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT53基因的克隆、表达和纯化 被引量：3
5
作者 唐宇龙 杨华 +3 位作者 刘湘新 秦莲花 柳彬 胡忠义 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2007年第1期14-16,共3页
目的构建结核杆菌分泌蛋白MPT53原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增MPT53基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET32a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转... 目的构建结核杆菌分泌蛋白MPT53原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增MPT53基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET32a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠埃希菌BL21,诱导表达MPT53融合蛋白,亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果成功构建PET32a-MPT53重组质粒,转化BL21后经IPGT诱导成功表达分子质量单位为36ku的MPT53蛋白,与理论值相符。结论成功表达结核分枝杆菌MPT53蛋白,为其应用打下了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 MPT53 克隆 表达
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检测结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6分泌蛋白双抗体夹心ELISA的建立 被引量：2
6
作者 唐宇龙 刘湘新 +2 位作者 杨华 柳彬 胡忠义 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1040-1042,1056,共4页
用重组蛋白CFP10-ESAT-6免疫新西兰大白兔,通过ELISA方法检测抗体效价水平;高效价抗体用DEAE-32阴离子交换柱纯化后,一部分抗体为包被所用,另一部分抗体用辣根过氧化物酶标记后,作为检测用,建立双抗体夹心法,进行了初步鉴定,确定该方法... 用重组蛋白CFP10-ESAT-6免疫新西兰大白兔,通过ELISA方法检测抗体效价水平;高效价抗体用DEAE-32阴离子交换柱纯化后,一部分抗体为包被所用,另一部分抗体用辣根过氧化物酶标记后,作为检测用,建立双抗体夹心法,进行了初步鉴定,确定该方法的可行性。结果表明:抗CFP10-ESAT-6多克隆抗体的效价在1∶16000稀释后D450值基本都达到1.0左右,在纯化、酶标记后,分别以1∶5000为包被工作浓度,1∶3000为酶标工作浓度时,能较高特异性检测结核杆菌培养上清分泌的CFP10-ESAT-6抗原。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 CFP10-ESAT-6 ELISA
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检测牛分枝杆菌的噬菌体生物扩增法的建立及初步应用
7
作者 钟志军 彭广能 +7 位作者 唐明霞 白永平 石梅 马晓平 胡忠义 王洁 秦莲花 杨华 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1224-1229,共6页
建立噬菌体生物扩增法（PhaB）检测牛分枝杆菌,将建立的方法用于22株牛分枝杆菌临床分离株及20种常见非结核分枝杆菌（NTM）及5种非分枝杆菌,同时对203头疑患牛结核病奶牛的奶样进行检测,其结果与皮内变态试验、涂片法、罗氏培养进行比... 建立噬菌体生物扩增法（PhaB）检测牛分枝杆菌,将建立的方法用于22株牛分枝杆菌临床分离株及20种常见非结核分枝杆菌（NTM）及5种非分枝杆菌,同时对203头疑患牛结核病奶牛的奶样进行检测,其结果与皮内变态试验、涂片法、罗氏培养进行比较。结果表明,噬菌体工作浓度为1×10^9 PFU/mL、37℃感染2 h为最佳检测条件;杀毒剂浓度为100 mmol/L,室温作用10 min即可完全杀灭受试噬菌体;加热灭活的细菌和指示细菌不被噬菌体感染;牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和22株牛分枝杆菌临床分离株检测结果均为阳性,16种NTM和5种非分枝杆菌为阴性,4种NTM（偶然、胞内、金色、草分枝杆菌）在高浓度时（〉10^5CFU/mL）检测结果为阳性;该法可检测出60-120 CFU/mL牛分枝杆菌;批内、批间变异系数均小于15%,重复性良好;203头检测奶牛中,PhaB法、涂片法、皮内变态试验和罗氏培养结果分别有14头（6.9%）、17头（8.4%）、21头（10.3%）和12头（6.0%）为阳性,PhaB法与其他3种方法比较,阳性准确性、特异性都在96%以上,敏感性在71%-100%。该法检测牛分枝杆菌具有快速、简便、灵敏、特异性高等特点。 展开更多
关键词 分枝杆菌噬菌体 牛分枝杆菌 检测方法 牛乳
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两种方法诊断梅花鹿结核病
8
作者 钟志军 彭广能 +1 位作者 白永平 胡忠义 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2007年第4期78-79,共2页
关键词 鹿结核病 诊断方法 梅花 抗生素治疗 病原分离 流行病学 细菌培养 持续性
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噬菌体生物扩增法检测犬结核病
9
作者 钟志军 彭广能 +3 位作者 白永平 唐明霞 石梅 胡忠义 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第3期35-36,共2页
2006年4月12日．四川省崇州市张某将两只贵宾犬（价值80余万元）送四川农业大学兽医院就诊。病犬在成都某宠物医院按照肺炎医治16天．但效果不佳，且症状加剧。在我院经实验室检测．最后确诊为犬结核病。其中一条犬因病情严重．来我院后... 2006年4月12日．四川省崇州市张某将两只贵宾犬（价值80余万元）送四川农业大学兽医院就诊。病犬在成都某宠物医院按照肺炎医治16天．但效果不佳，且症状加剧。在我院经实验室检测．最后确诊为犬结核病。其中一条犬因病情严重．来我院后第3天死亡。另一疑患结核病犬采取治疗．40天后出院．3个月后随访基本恢复健康。现报告如下． 展开更多
关键词 实验室检测 结核病 病犬 噬菌体 生物 四川农业大学 宠物医院 崇州市
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结核病诊断和耐药性检测新技术 被引量：11
10
作者 韩敏 乐军 《国际检验医学杂志》 CAS 2010年第3期260-262,共3页
全球结核病诊断主要采用痰涂片显微镜法,但是假阴性率高达50%,且不能鉴定结核杆菌的耐药性。2008年全球结核病控制的目标是使用更加敏感、快速的检测活动性结核病和耐药结核病的新型工具。多耐药结核病和广耐药结核病的不断增多,促进了... 全球结核病诊断主要采用痰涂片显微镜法,但是假阴性率高达50%,且不能鉴定结核杆菌的耐药性。2008年全球结核病控制的目标是使用更加敏感、快速的检测活动性结核病和耐药结核病的新型工具。多耐药结核病和广耐药结核病的不断增多,促进了新型的商品化的和非商品化的试验方法的发展,特别是针对资源有限的、高结核负担的地区的试验方法。本综述简述当前可应用的技术,特别是最新发展的高效的结核病诊断和结核病耐药性检测技术。 展开更多
关键词 结核 诊断 抗药性 细菌
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结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析 被引量：10
11
作者 马占忠 秦莲花 +1 位作者 王玉炯 胡忠义 《中华临床医师杂志（电子版）》 CAS 2007年第5期45-48,共4页
目的通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础。方法体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛... 目的通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础。方法体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,SELEX技术筛选获得ESAT-6的适体库,将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,找出高亲和性适体。结果经过13轮筛选,ssDNA文库与ESAT-6亲和力从0.257提高到1.163,且12轮后A值趋于平衡,克隆、测序获得ESAT-6的高亲和性适体,其中适体A10亲和力最高,达到1.515,且与CFP10-ESAT6融合蛋白无交叉反应。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与ESAT-6结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了ESAT-6的高亲和性适体。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 ESAT-6 指数级富集配体的系统进化技术 适体
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结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定 被引量：10
12
作者 秦莲花 马占忠 +3 位作者 郑瑞娟 刘忠华 陆俊梅 胡忠义 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期453-458,共6页
目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将... 目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将适配子库克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0，将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1，采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线，确定最佳阳性判定值，并构建散点图。结果经12轮筛选后，随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析，吸光度值为0．492—1．243，73．3％的适配子的吸光度值在1．0以上；二级结构分析显示，适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对；“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗（BCG）株]和阳性组（结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株）共47个菌株培养上清的检测结果显示，在临界（cut-off）值为0．61时，H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性，BCG株为阴性；阴性组标本的阴性检出率为85．7％，阳性组标本的阳性检出率为87．9％，表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 适体 核苷 SELEX适体技术 MPT64蛋白
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筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究 被引量：5
13
作者 马占忠 王玉炯 +3 位作者 秦莲花 丁元生 谢琴 胡忠义 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2008年第2期86-89,共4页
目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN... 目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linkedoligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力。结果构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 CFP-10 SELEX 适体
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结核分枝杆菌CE复合物对人单核-巨噬细胞的功能表型的影响及其作用机制 被引量：4
14
作者 杨鑫 冯永红 +3 位作者 刘中华 粟波 胡忠义 邓松华 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第2期124-127,共4页
目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ES-AT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞功能表型的影响及其作用的细胞信号传导通路。方法分别采用ELISA法以及流式细胞仪检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物在不同时间及浓度对人单核-... 目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ES-AT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞功能表型的影响及其作用的细胞信号传导通路。方法分别采用ELISA法以及流式细胞仪检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物在不同时间及浓度对人单核-巨噬细胞TNF-α产生对细胞表型的影响，并且应用各种细胞信号传导通路抑制剂来探讨CE复合物作用的细胞信号传导通路。结果结核分枝杆菌CE复合物能够在早期（6～8h）诱导人单核-巨噬细胞活化，大量产生TNF-α，但在晚期（〉48h），则没有此作用；细胞信号传导通路MEK1／2和p38 MAPK的选择性抑制剂SB203580、PD98059、U0126能抑制CE的这种作用；CE复合物在早期（18h）促进单核-巨噬细胞表面抗原提呈功能分子CD80、CD40的表达。结论CE复合物在感染早期可能通过激活MEK1／2和p38MAPK刺激单核巨噬细胞活化，但在晚期则没有此作用。在感染早期可能具有重要的抗结核保护作用。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 肿瘤坏死因子-Α
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人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建 被引量：3
15
作者 杨华 周新刚 +5 位作者 拾莉 冯永红 秦莲花 郑瑞娟 王洁 胡忠义 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期682-685,共4页
目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因，然后拼接装配成单链抗体基因... 目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因，然后拼接装配成单链抗体基因，重组于噬菌粒载体pCANTAB5S，转化大肠埃希菌E．coli TG1，以辅助噬菌体拯救后，构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库。结果成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，库容量达10^7。结论以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础，成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 噬菌体展示 单链抗体 文库
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三种方法检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的比较 被引量：3
16
作者 史可云 王洁 +3 位作者 杨华 张文宏 翁心华 胡忠义 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期77-80,共4页
目的探讨绝对浓度法、液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法和噬菌体生物扩增(PhaB)法检测结核分枝杆菌(MTB)吡嗪酰胺(PZA)耐药性的临床应用价值。方法应用3种方法同时检测90株MTB临床分离株PZA耐药性,并比较检测结果的敏感度、特异度、阳性... 目的探讨绝对浓度法、液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法和噬菌体生物扩增(PhaB)法检测结核分枝杆菌(MTB)吡嗪酰胺(PZA)耐药性的临床应用价值。方法应用3种方法同时检测90株MTB临床分离株PZA耐药性,并比较检测结果的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度。结果90株MTB临床分离株用绝对浓度法、液体培养基MIC法和PhaB法3种方法分别测得21株、33株、22株敏感株和69株、57株、68株耐药株。若以绝对浓度法测定结果为判断标准,则PhaB法检测PZA耐药性的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为94.2%、85.7%、95.6%、81.8%、92.2%;若以液体培养基MIC法测定结果为判断标准,则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为98.2%、63.6%、82.4%、95.5%、85.6%;若以绝对浓度法和液体培养基MIC法测定结果为判断标准,则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为96.4%、90.0%、96.4%、90.0%、94.7%。结论绝对浓度法尽管是目前国内常用的方法,但影响因素较多;液体培养基MIC法测定虽能提早报告药物敏感结果,但检测条件尚需优化;PhaB法检测快速、简便、安全,有一定的应用价值。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 抗药性 吡嗪酰胺 分枝杆菌噬菌体
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SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究 被引量：2
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作者 秦莲花 郑瑞娟 +3 位作者 杨华 冯永红 王洁 胡忠义 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期176-180,共5页
目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库，利用sELEX技术筛选，以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选，利用生物素-亲和素显色系... 目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库，利用sELEX技术筛选，以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选，利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性。结果SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系：PCR扩增的最佳退火温度为65℃；文库优化时，最佳Mg^2＋的浓度为1．5mmol／L；不对称PCR法制备ssDNA时，Mg^2＋的浓度为0．75mmol／L；以酶联板为介质筛选时，在10轮后筛选达到饱和，且随着筛选轮数的增加，PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密，亲和性检测显示第10轮获得的适配子库，比初始的文库亲和性吸光度（A）值增加了9．18倍。将适配子库克隆，随机挑取10个单克隆子，利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性，亲和性范围分布在0．572—1．606之间。结论已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 MPT64蛋白 SELEX DNA适配子 筛选方法 亲和性
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化 被引量：1
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作者 唐宇龙 丁元生 +4 位作者 杨华 毕爱笑 秦莲花 郑瑞娟 胡忠义 《国际呼吸杂志》 2007年第19期1441-1443,共3页
目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正... 目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 MPT64 克隆 表达
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显色法芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种 被引量：1
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作者 赵源 胡忠义 +6 位作者 景奉香 刘志辉 王洁 郑瑞娟 陆俊梅 赵辉 尹俊 《中国医药生物技术》 CSCD 2007年第6期422-427,共6页
目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法.方法 根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的分枝杆菌16S rDNA基因的保守区和突变区(第129～267位核苷酸的A突变区、第430～500位核苷酸的B突变区)分别设计引物和寡核苷酸探... 目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法.方法 根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的分枝杆菌16S rDNA基因的保守区和突变区(第129～267位核苷酸的A突变区、第430～500位核苷酸的B突变区)分别设计引物和寡核苷酸探针,用地高辛标记引物并制备玻璃芯片.采用双重PCR技术分别对16种分枝杆菌标准株、5种非分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株(非结核分枝杆菌40株、结核分枝杆菌复合群80株)进行扩增,扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测,尼龙膜显色,以显现蓝黑色斑点作为阳性信号,并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类.根据芯片杂交结果,选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行DNA测序.结果 16种分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株经PCR扩增均各产生2条DNA片段,其中1条长度为272～280 bp,1条长度为183～192 bp.16种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交,应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准株和5种非分枝杆菌标准株的特异性为100%.120株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针a杂交,其中79株确定为结核分枝杆菌复合群,38株确定为非结核分枝杆菌(不产色分枝杆菌17株,胞内分枝杆菌8株,猿猴分支杆菌6株,瘰疬分枝杆菌5株,偶然分支杆菌2株),另3株只与分枝杆菌属探针a杂交,没有鉴定到种.选取的26株分枝杆菌临床分离株(结核分枝杆菌复合群8株,不产色分枝杆菌5株,胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各3株,瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各2株)DNA测序显示,未鉴定到种的3株分枝杆菌中,1株为结核分枝杆菌突变株,1株为 Mycobacterium lentiflavum,1株为 Mycobacterium arupense,芯片上无后2种菌株的特异性探针;其余23株菌株测序结果与芯片检测结果一致.结论 显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特 展开更多
关键词 芯片分析技术 分枝杆菌属 DNA 细菌 聚合酶链反应
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变性高效液相色谱检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药性
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作者 杨华 张泽云 +3 位作者 王洁 秦莲花 冯永红 胡忠义 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期-,共4页
乙胺丁醇(EMB)的初始耐药率与获得性耐药率均超过1%[1].研究发现,在耐受EMB的菌株中,约60%发生embB基因306位点突变[2].因此,该点突变的检测对结核分枝杆菌(MTB)耐受EMB的临床诊断具有重要意义.
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