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抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建 被引量：8
1
作者 严安 孙冰玉 +8 位作者 夏立亮 吴标 包文静 车小燕 孙志伟 金维荣 赵国屏 熊慧 王颖 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期44-49,共6页
目的:构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库),为抗H5N1的VHH抗体筛选奠定基础。方法:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼,一定免疫时间后测定小羊驼外周血清中抗体中和活性,分离其外周淋巴细胞,利用RT-PCR方法... 目的:构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库),为抗H5N1的VHH抗体筛选奠定基础。方法:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼,一定免疫时间后测定小羊驼外周血清中抗体中和活性,分离其外周淋巴细胞,利用RT-PCR方法得到VHH抗体片段。通过优化连接和电转化方法,将足量VHH片段与pCANTAB5E连接后电转入大肠杆菌TG1,获得VHH抗体基因库;检测基因库库容以及多样性,并采用血凝抑制试验对噬菌体抗体库进行初步功能性鉴定。结果:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼四次后,其外周血清中抗体血清抑制效价可达1∶2 560,构建的VHH抗体基因库库容可达3×108,随机挑选14个抗体基因克隆进行测序鉴定,结果显示均为独立克隆,表明所建抗体库多样性好。上述基因库经辅助噬菌体拯救后,得到抗H5N1的噬菌体VHH型抗体初级库,对初级库进行血凝抑制试验,结果呈阳性,表明初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1抗体。结论:结果表明,已成功构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链抗体库,为进一步筛选抗H5N1禽流感的重链抗体打下良好基础,并为H5N1的早期临床诊断和治疗提供新的手段。 展开更多
关键词 H5N1 噬菌体抗体库 重链可变区抗体 禽流感病毒
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微孔板蛋白质芯片技术应用于单克隆抗体分型研究 被引量：5
2
作者 宋凯 周佳菁 +5 位作者 叶赛 彭海林 王升年 肖华胜 赵国屏 张庆华 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期56-60,共5页
设计与构建了可用于单克隆抗体分型鉴定的微孔板蛋白质芯片,利用该芯片进行了12株单克隆抗体和2种多克隆抗体的分型鉴定,并与ELISA方法进行了对比。结果表明,蛋白质芯片方法对单克隆抗体和多克隆抗体进行鉴定的结果,与ELISA方法进行鉴... 设计与构建了可用于单克隆抗体分型鉴定的微孔板蛋白质芯片,利用该芯片进行了12株单克隆抗体和2种多克隆抗体的分型鉴定,并与ELISA方法进行了对比。结果表明,蛋白质芯片方法对单克隆抗体和多克隆抗体进行鉴定的结果,与ELISA方法进行鉴定的结果一致;与ELISA方法相比,蛋白质芯片的方法降低了试剂与样品的用量,缩短了工作时间,提高了工作效率。对于高通量的单克隆抗体制备体系,单克隆抗体分型蛋白质芯片是一种敏感、快捷的分型鉴定工具。 展开更多
关键词 蛋白质芯片 单克隆抗体 分型
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禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：4
3
作者 单松华 汪敏 +4 位作者 金维荣 刘俊平 秦红友 陶琦 吴徐华 《上海交通大学学报（农业科学版）》 2006年第6期507-512,共6页
根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-... 根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。 展开更多
关键词 禽流感(AIV) 新城疫病毒(NDV) 多重RT-PCR 禽产品 检测
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蛋白质芯片技术应用于高通量单克隆抗体制备研究 被引量：3
4
作者 宋凯 叶赛 +6 位作者 周佳菁 彭海林 王升年 卫玲 肖华胜 赵国屏 张庆华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期1116-1120,共5页
针对在传统的单克隆抗体制备过程中进行特异性筛选时大量的人力消耗,建立了一种联合应用蛋白质芯片进行单克隆抗体制备的方法。用8种重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠,在传统的细胞融合的基础上,将8种抗原免疫的杂交瘤阳性细胞混合后进行克... 针对在传统的单克隆抗体制备过程中进行特异性筛选时大量的人力消耗,建立了一种联合应用蛋白质芯片进行单克隆抗体制备的方法。用8种重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠,在传统的细胞融合的基础上,将8种抗原免疫的杂交瘤阳性细胞混合后进行克隆化、蛋白质芯片筛选,阳性细胞有限稀释克隆化制备相关抗体。实验结果:混合克隆化共得到单克隆细胞175孔,经蛋白质芯片筛选出阳性孔119孔,选择针对单一抗原阳性的细胞连续2轮克隆化,8种重组蛋白各获得单克隆抗体细胞株1株。与经典的单克隆抗体制备相比,蛋白质芯片筛选与混合克隆化技术联合应用于单克隆抗体制备,1个筛选周期获得了8种重组蛋白的单克隆抗体细胞株,提高了单克隆抗体的制备效率,节省了在筛选中的抗原用量,提供了一种经济、快速、简便的方法。 展开更多
关键词 蛋白质芯片 单克隆抗体 克隆化 筛选
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ABL激酶区突变的检测与伊马替尼耐药 被引量：4
5
作者 崔亚娟 王光平 +2 位作者 徐嘉鹰 信红亚 袁小瑜 《中南药学》 CAS 2013年第3期161-165,共5页
目的研究慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者ABL酪氨酸激酶区突变及伊马替尼耐药。方法用巢式RT-PCR对35例CML患者骨髓液BCR-ABL mRNA内ABL激酶区序列进行逆转录、扩增,测序和同源性比较分析ABL激酶区突变,并分析其伊... 目的研究慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者ABL酪氨酸激酶区突变及伊马替尼耐药。方法用巢式RT-PCR对35例CML患者骨髓液BCR-ABL mRNA内ABL激酶区序列进行逆转录、扩增,测序和同源性比较分析ABL激酶区突变,并分析其伊马替尼耐药。结果 35例患者检出突变16例,阳性率45.71%。CML慢性期、加速期、急变期患者突变率分别为47.83%(11/23)、50%(1/2)和40%(4/10),其差异无显著性(P=0.858);16例突变患者中,共检出26种点突变,包括Y253H、T315I、F317L、M351T、L387F、A380D、H396R、G398R、D455G、E459K和1例185 bp碱基缺失突变等。其中A269V、D274G、S286G、V299M、C305Y、R307W、G312R、I314V、L324Q、K356E、D381G、K403E、K419E、L471P、A474T和S485P突变暂未见文献报道,可能为新的突变。在这些新发现的突变中,D274G、S286G、C305Y和K356E等突变可能与伊马替尼(imatinib,IM)治疗抗性有关。结论约半数患者存在ABL激酶区突变,突变位点广泛,性质多样,既存在单一位点突变,也可多位点同时存在,突变的发生与年龄、性别无关,部分突变与伊马替尼耐药有关。ABL基因激酶区突变检测有助于酪氨酸激酶抑制剂疗效的评估、治疗方案的调整。 展开更多
关键词 ABL酪氨酸激酶 突变 酪氨酸酶抑制剂 慢性粒细胞白血病 耐药
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人巨细胞病毒pp65抗体检测方法的建立 被引量：1
6
作者 钱春艳 吴晓玲 +2 位作者 张玥 王升年 季育华 《检验医学》 CAS 北大核心 2006年第B10期8-10,共3页
目的建立检测人巨细胞病毒pp65IgG抗体（HCMV pp65 IgG）的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法通过棋盘滴定法选择包被抗原和酶标二抗的最适浓度：以商品抗HCMV pp65单抗为阳性模拟标本，建立检测抗HCMV pp65 IgG抗体，并对临床收集... 目的建立检测人巨细胞病毒pp65IgG抗体（HCMV pp65 IgG）的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法通过棋盘滴定法选择包被抗原和酶标二抗的最适浓度：以商品抗HCMV pp65单抗为阳性模拟标本，建立检测抗HCMV pp65 IgG抗体，并对临床收集的各类血清标本进行检测和分析。结果检测间接ELISA HCMV pp65 IgG的最佳包被抗原浓度为10ng／孔，酶标二抗的工作浓度为1：3000。当阳性吸光度似）值为0．298时，87份不同组的血清标本（HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组）阳件检出率分别为51．6％（16／31）、12．1％（4／33）和0．0％（0／23）。3组两两间差异均存在显著性（P〈0．01）。结论本研究建立了检测HCMV pp65抗体的方法，应用该方法能从相应人群中检出该抗体，检测不存在假阳性，并发现该抗体与抗HCMV IgM的检出有关。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 IgC抗体 pp65重组抗原 酶联免疫吸附试验
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人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测 被引量：1
7
作者 刘建玲 康雪莲 +4 位作者 董辉 王嘉颖 曹琳 徐晓晶 金维荣 《生物学杂志》 CAS CSCD 2010年第3期20-23,47,共5页
提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b(+),将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,... 提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b(+),将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b(+)。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用(酪蛋白为底物),重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。 展开更多
关键词 分泌磷蛋白2 基因克隆 原核表达 纯化 生物活性
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测序法及液相芯片杂交法对生殖道人乳头瘤病毒感染分型的比较 被引量：8
8
作者 齐淑贞 王千秋 +7 位作者 谈玉 沈艳 李波 陈淑丽 程刚 秦红友 尤志学 周兵斌 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期181-185,共5页
目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)分型方法在临床标本应用中的特异性及敏感性。方法采用通用型引物用PCR方法对尖锐湿疣及宫颈细胞内瘤变组织标本进行HPV DNA检测,测序法及液相芯片杂交法(luminex法)对其进行分型。结果在单型感染中测序法较... 目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)分型方法在临床标本应用中的特异性及敏感性。方法采用通用型引物用PCR方法对尖锐湿疣及宫颈细胞内瘤变组织标本进行HPV DNA检测,测序法及液相芯片杂交法(luminex法)对其进行分型。结果在单型感染中测序法较为准确,而在多型感染中luminex法占一定优势。结论测序法结合luminex法可以运用在HPV感染标本中的分型。 展开更多
关键词 尖锐湿疣 宫颈癌 宫颈上皮细胞内瘤变 人乳头瘤病毒 测序 液相芯片杂交法
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基因检测技术在尘肺病预防中的应用研究
9
作者 刘祖建 金维荣 +1 位作者 肖自力 姜俊成 《安全》 2012年第9期4-7,共4页
本文从基因组学、分子医学、临床医学和职业安全健康管理的角度,综合近年来最新的研究成果,阐明应用基因检测技术进行尘肺病易感人群风险筛查的技术原理、可行性及具体做法,从而达到有效降低尘肺病发病率的目的。
关键词 基因检测 尘肺病 预防
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