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应用高分辨率熔解曲线分析和焦磷酸测序快速筛查线粒体糖尿病MT3243处〉G突变 被引量:1
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作者 危新俊 杜秀娟 +1 位作者 王从容 颜景斌 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期447-451,共5页
目的建立快速、准确、无创、低成本的线粒体糖尿病MT3243A:〉G位点突变的筛查方法。方法采集上海市儿童医院和上海市第六人民医院确诊的6例线粒体糖尿病患者及50名正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本,用焦磷酸测序法进行检测,并比较... 目的建立快速、准确、无创、低成本的线粒体糖尿病MT3243A:〉G位点突变的筛查方法。方法采集上海市儿童医院和上海市第六人民医院确诊的6例线粒体糖尿病患者及50名正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本,用焦磷酸测序法进行检测,并比较不同来源样本中MT3243A〉G突变位点的杂合度水平;应用高分辨率熔解曲线(highresolutionmeltingcurveanalysis,HRM)对来自上海市4个社区的1070例糖尿病患者尿沉渣样本中的MT3243A〉G突变位点进行快速筛查,阳性样本进一步采用焦磷酸测序技术进行验证,并定量检测突变位点的杂合度水平。结果对比实验发现,6例线粒体糖尿病患者尿沉渣中MT3243A〉G突变位点的杂合度均高于唾液和血液2~7倍,唾液中突变的杂合度略高于血液;在50名正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本中均未检出MT3243A〉G位点突变。在1070例糖尿病尿沉渣样本的筛查实验中,用HRM筛查出2例疑似MT3243A〉G位点突变的样本,经焦磷酸测序验证后确认为MT3243A〉G位点突变,两例患者尿沉渣样本中MT3243A〉G位点杂合度分别为33.32%和14.67%。结论尿沉渣样本取材方便、无创、突变杂合度高,可作为人群中MT3243A〉G位点突变筛查的首选样本。HRM技术使用成本低,可实现点突变的快速筛查。焦磷酸测序技术检测灵敏度高、定量精确。我们将两者的优势相结合,建立了用两步法快速筛查检测线粒体糖尿病MT3243A〉G位点突变的新方法。 展开更多
关键词 MT3243A〉G突变 线粒体糖尿病 尿沉渣 高分辨率熔解曲线 焦磷酸测序 快速筛查
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一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体准ФC31整合酶功能的双荧光报告系统(英文)
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作者 徐焕宇 马晴雯 +4 位作者 任兆瑞 巩芷娟 黄淑帧 曾凡一 曾溢滔 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第7期929-933,共5页
在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体准ФC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码准ФC31整合酶的载体共转染可以反映准ФC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式... 在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体准ФC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码准ФC31整合酶的载体共转染可以反映准ФC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出.随着转染中准ФC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升.准ФC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10∶1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率.这表明该准ФC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价准ФC31整合酶功能的方法. 展开更多
关键词 ФC31整合酶 报告系统 位点特异性重组 NIH3T3细胞系
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流式细胞术检测人/山羊嵌合体中人源细胞方法的建立与应用
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作者 王娟 陈美珏 +3 位作者 巩芷娟 任兆瑞 曾凡一 黄淑帧 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期441-445,共5页
目的建立应用流式细胞术检测人/山羊嵌合体中人源细胞的方法。方法通过宫内移植的方法将标记有绿色荧光蛋白(GFP)的人造血干/祖细胞(MIG细胞)移植入胎山羊腹腔内,从而获得人/山羊嵌合体模型(MIG羊)。采集MIG羊的外周血,以数... 目的建立应用流式细胞术检测人/山羊嵌合体中人源细胞的方法。方法通过宫内移植的方法将标记有绿色荧光蛋白(GFP)的人造血干/祖细胞(MIG细胞)移植入胎山羊腹腔内,从而获得人/山羊嵌合体模型(MIG羊)。采集MIG羊的外周血,以数十种鼠抗人的抗体标记,筛选出对人源细胞特异性强而与山羊细胞无或仅有微弱交叉反应的抗体,列人流式细胞仪常规检测的首选抗体,继而在非移植山羊的外周血中加入不同比例(25%、50%、75%和100%)的人脐血细胞,用CD34^+表面抗体标记来观察人脐血细胞和人CD34细胞的分布,以决定“门”的区域和大小;取MIG羊的肝脏,应用流式细胞术检测灌流后肝实质细胞中GFP细胞的比例及DNA含量。结果筛选出CD7、CD15、CD38、CD45、CD20、CD34、CD14和血型糖蛋白A(GPA)等8种单抗作为检测嵌合体中人源细胞的首选抗体;确定了进行流式细胞分析时“门”的大小和区域;MIG羊肝实质细胞中,GFP^+细胞的比例为29.1%(29100/100000);DNA含量测定结果显示MIG羊肝组织分选获得的GFP^+细胞主要呈现2个峰,其位置与人的双峰位置相对应。结论流式细胞术是研究干细胞在体内分化、归巢和生物学特征的快速、简便、有效的方法;表面抗体以及“门”的选择对于准确检测人/山羊嵌合体中人源细胞至关重要。 展开更多
关键词 流式细胞术 造血干细胞 移植嵌合体 抗原 表面
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表达β-珠蛋白基因的安全性慢病毒载体的优化
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作者 韩亚丽 杨冠恒 +2 位作者 陈雁雯 龚秀丽 张敬之 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期50-57,共8页
目的:慢病毒载体(lentiviral vector,LVV)是一种有效的基因治疗导入系统。拟用已研发的携带人的β-珠蛋白基因自删除慢病毒载体,优化其表达有效性和提高其病毒颗粒数。方法:比较三款不同的启动子预测软件的分析结果,分别构建三种不... 目的:慢病毒载体(lentiviral vector,LVV)是一种有效的基因治疗导入系统。拟用已研发的携带人的β-珠蛋白基因自删除慢病毒载体,优化其表达有效性和提高其病毒颗粒数。方法:比较三款不同的启动子预测软件的分析结果,分别构建三种不同长度启动子的表达β-珠蛋白基因(β-globin)的LVV,并对其Ⅱ号内含子进行部分删减;用经优化的LVV转导β-地中海贫血(β-地贫)的小鼠诱导性多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)后,用此iPSC制备嵌合体小鼠模型;经RT-PCR、血涂片瑞氏吉姆萨染色等观察分析其功能性代偿的潜能。研究结果:经优化后的自删除慢病毒载体病毒对其病毒颗粒数的滴度影响不大(2.3×10^(11)LPs/ml),可在嵌合体小鼠模型体内检测到正常人β-珠蛋白基因的功能性表达。结论:优化了表达人β-珠蛋白基因的自删除LVV。 展开更多
关键词 Β-地中海贫血 自删除慢病毒载体 优化 基因治疗
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基于实时荧光定量PCR技术的唐氏综合征嵌合体小鼠嵌合率检测和分析
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作者 孟晓伟 杨冠恒 +1 位作者 王云杰 马晴雯 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期1277-1282,共6页
目的·建立一种定量检测唐氏综合征嵌合体小鼠各脏器嵌合情况的方法,并初步探究其不同器官中的嵌合规律。方法·分别针对唐氏综合征模型Tc1小鼠细胞(三体细胞)内人源21号染色体(记为Hsa21)上SIM2基因和小鼠15号染色体(记为Mmu15... 目的·建立一种定量检测唐氏综合征嵌合体小鼠各脏器嵌合情况的方法,并初步探究其不同器官中的嵌合规律。方法·分别针对唐氏综合征模型Tc1小鼠细胞(三体细胞)内人源21号染色体(记为Hsa21)上SIM2基因和小鼠15号染色体(记为Mmu15)上Derl1基因设计引物,采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)技术对SIM2和Derl1进行检测来反映Hsa21和Mmu15的比例,并以此计算嵌合体小鼠各器官中Tc1小鼠细胞的嵌合占比。结果·所鉴定的小鼠中有3只为嵌合体小鼠。该3只小鼠心脏组织Tc1小鼠细胞嵌合率分别为8.98%、21.71%和57.70%,小脑组织分别为5.62%、20.17%和40.43%,大脑组织分别为8.48%、15.35%和20.45%,肝脏组织分别为2.66%、6.50%和16.84%,脾脏组织分别为1.73%、3.80%和11.80%。结论·基于qPCR技术对不同染色体上的基因进行定量分析的方法可用于唐氏综合征嵌合体小鼠中三体细胞嵌合率的定量检测。Tc1小鼠细胞在嵌合体小鼠的心脏、小脑、大脑、肝脏、脾脏均可发生嵌合,心脏组织的嵌合率偏向最高。 展开更多
关键词 唐氏综合征 嵌合体 小鼠模型 实时荧光定量PCR 嵌合率
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位点特异整合微环DNA的体内制备
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作者 聂永强 马海燕 马晴雯 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期80-87,共8页
目的:应用诱导表达的LR克隆酶系统,建立一种在细菌体内获得基于链霉菌噬菌体ФC31整合酶系统的位点特异整合型微环DNA的方法,为实现无细菌骨架等冗余序列的转基因奠定基础。方法:构建包含阿拉伯糖启动子的LR克隆酶系统和ФC31整合酶系... 目的:应用诱导表达的LR克隆酶系统,建立一种在细菌体内获得基于链霉菌噬菌体ФC31整合酶系统的位点特异整合型微环DNA的方法,为实现无细菌骨架等冗余序列的转基因奠定基础。方法:构建包含阿拉伯糖启动子的LR克隆酶系统和ФC31整合酶系统的亲本质粒,在L-阿拉伯糖的诱导下重组产生表达ФC31整合酶的微质粒和包含有目的基因和attB位点等元件的微环DNA。以限制性内切核酸酶酶切电泳定性其重组效率,qPCR定量分析微环、微质粒及亲本质粒的比例,定量计算重组效率。观察随着诱导时间的推进微环/微质粒值的变化。结果:细菌体内LR克隆酶系统可有效催化亲本质粒的重组,重组率达85%以上。相比商品化LR克隆酶体外反应具有更高的稳定性而且更经济。结论:获得了一种高效、稳定的细菌体内产生位点特异性整合型微环DNA的亲本质粒。 展开更多
关键词 微环DNA LR克隆酶系统位点特异性整合 阿拉伯糖启动子ФC31 整合酶
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