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黑曲霉β-木糖苷酶An-xyl的重组表达与木糖耐受性表征
1
作者 李乐 彭程 +5 位作者 于坤朋 唐艺玲 林燕玲 李利君 倪辉 李清彪 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4593-4607,共15页
木糖苷酶催化低聚木糖水解在木质纤维素降解中起重要作用,但该酶活性易被产物木糖抑制,严重限制了其应用。基于分子对接,本文研究了茶梗发酵培养基差异表达显著的黑曲霉(Aspergillus niger)β-木糖苷酶An-xyl与木糖的亲和性,并对其进行... 木糖苷酶催化低聚木糖水解在木质纤维素降解中起重要作用,但该酶活性易被产物木糖抑制,严重限制了其应用。基于分子对接,本文研究了茶梗发酵培养基差异表达显著的黑曲霉(Aspergillus niger)β-木糖苷酶An-xyl与木糖的亲和性,并对其进行克隆表达和性质表征,进一步探讨了该酶与纤维素酶对茶梗中木质纤维素的降解作用。分子对接结果表明,An-xyl与木糖的亲和性低于木糖耐受性较差的米曲霉β-木糖苷酶xyl A。重组表达的An-xyl木糖抑制常数Ki值为433.2 mmol/L,与同为GH3家族的β-木糖苷酶相比木糖耐受性较高。以p NPX为底物时,K_(m)和V_(max)分别为3.6 mmol/L和10000μmol/(min·mL)。An-xyl最适温度65℃,最适pH 4.0,65℃处理300 min能保持约61%的酶活力,在pH2.0-8.0的范围内处理24h后酶活力仍能维持80%左右。添加An-xyl与纤维素酶共同水解茶梗,反应2h和4h产生还原糖含量比单独使用纤维素酶水解分别提高了19.3%和38.6%。本研究表明,通过差异表达挖掘的An-xyl具有高木糖耐受性和较好的催化活性和稳定性,可协同作用水解茶梗类木质纤维素,丰富了具有高木糖耐受性β-木糖苷酶的资源,为其应用提供了实验依据。 展开更多
关键词 黑曲霉 Β-木糖苷酶 木糖耐受性 茶梗 木质纤维素
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Leifsonia sp.ZF2019中一种新型耐木糖β-木糖苷酶的表达与特征 被引量：2
2
作者 何易 焦镕虎 +2 位作者 王晨曦 王茜 许光治 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1452-1463,共12页
【目的】从栀子灰蝶幼虫分离的Leifsonia sp.ZF2019菌株中克隆表达出一种新型β-木糖苷酶Xyl4900,并研究其酶学性质,以期为开发适用于工业生产的β-木糖苷酶提供参考。【方法】采用生物信息学分析技术分析Leifsonia sp.ZF2019菌株的β-... 【目的】从栀子灰蝶幼虫分离的Leifsonia sp.ZF2019菌株中克隆表达出一种新型β-木糖苷酶Xyl4900,并研究其酶学性质,以期为开发适用于工业生产的β-木糖苷酶提供参考。【方法】采用生物信息学分析技术分析Leifsonia sp.ZF2019菌株的β-木糖苷酶Xyl4900基因并在大肠杆菌中表达了该基因,纯化并研究了其酶学性质。【结果】Xyl4900与GH3家族的β-葡萄糖苷酶同源性高,但带有β-木糖苷酶结构域,可特异性水解对硝基苯基β-D-吡喃木糖苷(pNPX),是一种新型β-木糖苷酶。酶学特性分析显示,Xyl4900在45℃和pH 7.0的条件下酶活性最高,且在pH 6.0–9.0的范围内孵育14 h,仍保持80%以上的酶活力。除Cu^(2+)外,其他金属离子(2.5 mmol/L)对Xyl4900酶活力无明显影响,且对低浓度有机溶剂(5%V/V)有较强耐受性。此外,在20%(W/V)NaCl或100 mmol/L木糖溶液中Xyl4900的酶活性仍高于50%,表现出较好的盐和木糖耐受性。动力学参数分析显示,Xyl4900的K_(m)值、V_(max)值和木糖抑制常数K_(i)值分别为0.80 mmol/L、36.10 U/mg和150.12 mmol/L。特别地,Xyl4900能够很好地降解木二糖、木三糖。【结论】Xyl4900具有良好的pH稳定性、木糖及盐耐受性,能够较好地应用到半纤维素降解和其他工业生产中。 展开更多
关键词 Leifsonia sp.ZF2019 GH3糖苷水解酶 Β-木糖苷酶 盐耐受性 木糖耐受性
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混合糖发酵条件下甲酸抑制木糖发酵的机制 被引量：3
3
作者 张影 苟敏 +2 位作者 孙照勇 夏子渊 汤岳琴 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期990-998,共9页
纤维素燃料乙醇生产面临的一个重要问题是纤维素原料预处理过程中产生多种副产物会显著抑制酿酒酵母的生长繁殖和发酵,其主要成分弱酸类中甲酸被认为具有最强的抑制效应.为了解工业酿酒酵母混合糖发酵时木糖利用被甲酸特异性显著抑制的... 纤维素燃料乙醇生产面临的一个重要问题是纤维素原料预处理过程中产生多种副产物会显著抑制酿酒酵母的生长繁殖和发酵,其主要成分弱酸类中甲酸被认为具有最强的抑制效应.为了解工业酿酒酵母混合糖发酵时木糖利用被甲酸特异性显著抑制的机制,为发酵菌株的抑制物耐受育种提供依据,以乙酸存在条件下的发酵为对照,研究甲酸存在条件下菌株分别发酵混合糖和单独木糖时的发酵性能以及糖代谢相关基因的表达差异、葡萄糖浓度对菌株发酵木糖和木糖代谢基因表达的影响,同时研究甲酸存在条件下葡萄糖代谢产物乙酸和乙醇对菌株发酵木糖的影响以及混合糖和单独木糖发酵过程中甲酸浓度变化和甲酸脱氢酶基因FDH1转录情况.结果显示:葡萄糖只有在甲酸存在条件下才特异性地显著抑制木糖发酵,木糖消耗速率的下降与木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)酶活下降有关;单独木糖发酵时,只有当乙酸、乙醇和甲酸共存时才表现出抑制效应,且随乙醇浓度增加抑制效应越明显,木糖发酵被抑制与XDH酶活下降有关,但乙酸、乙醇和甲酸三者对木糖发酵的协同抑制效应明显弱于60 g/L葡萄糖存在时的抑制;混合糖发酵时FDH1基因转录被抑制导致甲酸分解缓慢,对甲酸存在条件下木糖发酵被抑制有部分贡献.综上,葡萄糖抑制甲酸分解与葡萄糖代谢产物乙酸、乙醇和甲酸的协同抑制对混合糖发酵时甲酸对木糖发酵特异性显著抑制有贡献,但尚存在其他未知抑制机制,还需进一步深入研究. 展开更多
关键词 纤维素燃料乙醇 酿酒酵母 木糖发酵 抑制物耐受 甲酸抑制 混合糖发酵
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新型木糖发酵酵母Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907与传统木糖发酵酵母Pichia stipitis NRRL Y-7124乙醇发酵性能比较 被引量：2
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作者 张鑫鑫 陈叶福 +3 位作者 付更新 黄文连 郭学武 肖冬光 《酿酒科技》 北大核心 2014年第7期20-25,共6页
木糖乙醇转化率低是木质纤维素乙醇工业化生产尚未突破的技术瓶颈,选育高效发酵木糖产乙醇菌株一直是木质纤维素乙醇领域的研究热点。Spathaspora passalidarum是新近从自然界筛选到的一种新型发酵木糖产乙醇酵母,Pichia stipitis是已... 木糖乙醇转化率低是木质纤维素乙醇工业化生产尚未突破的技术瓶颈,选育高效发酵木糖产乙醇菌株一直是木质纤维素乙醇领域的研究热点。Spathaspora passalidarum是新近从自然界筛选到的一种新型发酵木糖产乙醇酵母,Pichia stipitis是已知木糖乙醇转化效率相对较高的酵母菌。从胁迫耐受性（乙醇、温度、渗透压）,糖发酵能力（葡萄糖、木糖、葡萄糖和木糖混合糖）,高温发酵能力方面对S.passalidarum NRRLY-27907和P.stipitis NRRLY-7124进行了比较。结果表明,NRRL Y-27907对高浓度乙醇、高温、高渗条件的耐受性比NRRL Y-7124更强。NRRL Y-27907葡萄糖发酵能力略低于NRRL Y-7124,但木糖发酵能力优于NRRL Y-7124。更为突出的是,NRRL Y-27907的葡萄糖阻遏效应较弱,葡萄糖和木糖混糖发酵能力明显优于NRRL Y-7124。在30～39℃下,NRRL Y-27907的木糖乙醇发酵能力皆优于NRRL Y-7124,具有更好的高温发酵潜力。因此,Spathaspora passalidarum在木质纤维素-生物乙醇转化方面具有很好的应用潜力。 展开更多
关键词 微生物 Spathaspora passalidarum 生物乙醇 木糖 胁迫耐受性 高温发酵 PICHIA stipitis
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木糖发酵酿酒酵母抑制物耐受能力提升及利用秸秆原料的乙醇发酵性能 被引量：2
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作者 丁伟军 李波 +3 位作者 张影 陈娅婷 缪晡 汤岳琴 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期879-888,共10页
木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;... 木糖利用能力和抑制物耐受能力优良的工业酿酒酵母菌株以及合理的糖化发酵工艺是纤维素燃料乙醇生产的两个关键.对一株工业酿酒酵母菌的磷酸戊糖途径转醛醇酶基因TAL1进行差异过表达,评价其在8种典型抑制物存在时对菌株利用木糖的影响;利用TAL1过表达菌株研究油菜秸秆预处理物料中抑制物含量高低对分步糖化发酵（SHF）、预糖化-同步糖化发酵（P-SSF）和同步糖化发酵（SSF）3种不同糖化发酵方式发酵过程的影响,探讨高固含量发酵的可行性.结果显示,TAL1基因过表达提高了菌株的木糖代谢能力和对8种典型抑制物的耐受能力,适度过表达菌株表现最优,有抑制物存在时的木糖消耗速率提升了20%-70%.秸秆预处理物料中抑制物总含量约为4 g/L时,SHF无法正常发酵,SSF的乙醇收率接近70%,略高于P-SSF;当物料中抑制物总含量下降到约2 g/L时,3种方式都能顺利发酵,SSF表现最优,96 h时的乙醇收率为86.5%,但SSF（96 h）和P-SSF（112 h）所需糖化发酵总时间远低于SHF（144 h）;总固含量约为25%的分批补料-同步糖化发酵（FB-SSF）的乙醇浓度和乙醇收率分别达到54.2 g/L和67.2%.上述结果表明,TAL1基因适度过表达提升了菌株的木糖发酵和抑制物耐受能力,菌株已具备比较优秀的发酵和耐受抑制物的能力;预处理物料中抑制物含量相对较高时采用SSF或P-SSF工艺,而抑制物浓度相对较低时,3种糖化发酵方式都可以采用,但SSF所需发酵时间最短,生产能力最高. 展开更多
关键词 纤维素燃料乙醇 木糖发酵 抑制物耐受 分步糖化发酵(SHF) 预糖化-同步糖化发酵(P-SSF) 同步糖化发酵(SSF) 分批补料-同步糖化发酵(FB-SSF) TAL1基因
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黑麦草纤维发酵产乙醇菌种的筛选及特性研究
6
作者 吴馨娜 杨再福 +1 位作者 孙利红 张程 《中国酿造》 CAS 北大核心 2010年第10期41-44,共4页
从酒渣、土壤和酵母粉3种样品中筛选出可利用黑麦草纤维发酵生产乙醇的菌种。试验利用梯度法和划线分离法从3种样品中筛选出18株酵母菌,其中有3菌株可高效利用木糖,通过理化分析及预发酵试验,确定其中的Rr菌株最适合黑麦草纤维的发酵;... 从酒渣、土壤和酵母粉3种样品中筛选出可利用黑麦草纤维发酵生产乙醇的菌种。试验利用梯度法和划线分离法从3种样品中筛选出18株酵母菌,其中有3菌株可高效利用木糖,通过理化分析及预发酵试验,确定其中的Rr菌株最适合黑麦草纤维的发酵;并对其耐受性的研究表明,其pH值耐受范围为3.3~5.2、最佳木糖浓度为0.02g/mL、耐受NaCl浓度范围为0.00~0.04g/mL、耐受乙醇浓度为0%vol^4%vol。 展开更多
关键词 木糖 乙醇 酵母菌 耐受性
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微生物利用木质纤维素的研究进展 被引量：15
7
作者 马泽林 刘家亨 +2 位作者 黄序 财音青格乐 朱宏吉 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期124-133,共10页
木质纤维素原料是世界上最为丰富的资源之一,可用作微生物发酵生产高附加值生物化学品的原料。与传统用于微生物发酵的可食用生物质原料相比,目前微生物利用木质纤维素还存在以下几个关键问题:开发经济有效的木质纤维素预处理工艺、提... 木质纤维素原料是世界上最为丰富的资源之一,可用作微生物发酵生产高附加值生物化学品的原料。与传统用于微生物发酵的可食用生物质原料相比,目前微生物利用木质纤维素还存在以下几个关键问题:开发经济有效的木质纤维素预处理工艺、提高微生物对木质纤维素水解液中第二大单糖木糖的有效利用水平、增强微生物对木质纤维素水解液中混糖的综合利用能力以及提高微生物对木质纤维素水解液中糠醛、乙酸等发酵抑制物的耐受能力。综述了近年来国内外针对这几个关键问题的最新研究成果。为今后微生物大规模利用木质纤维素进行商业生产提出了展望和建议。 展开更多
关键词 木质纤维素 木糖 碳代谢抑制 耐受性 化学品
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转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能 被引量：1
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作者 肖琴 曾维怡 +1 位作者 汤岳琴 木田建次 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1094-1108,共15页
【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径... 【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。 展开更多
关键词 纤维素燃料乙醇 TAL1基因 木糖发酵 乙酸耐受性
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