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重组人Tim-3蛋白的制备及基于亲和超滤-液质联用技术的天然配体筛选 被引量：2
1
作者 杨忠杰 李森森 +3 位作者 曹娟 应真真 张永威 王瑞 《药物评价研究》 CAS 2023年第3期545-551,共7页
目的构建人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)-His表达载体,表达纯化Tim-3重组蛋白,建立亲和超滤-液质联用技术筛选Tim-3蛋白天然配体。方法利用DNA重组技术构建人Tim-3-His表达质粒,转染HEK293细胞表达Tim-3重组蛋白,通过Ni柱亲和色谱柱... 目的构建人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)-His表达载体,表达纯化Tim-3重组蛋白,建立亲和超滤-液质联用技术筛选Tim-3蛋白天然配体。方法利用DNA重组技术构建人Tim-3-His表达质粒,转染HEK293细胞表达Tim-3重组蛋白,通过Ni柱亲和色谱柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析Tim-3重组蛋白纯度。10μL受试物(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、白术内酯Ⅰ、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮)溶液、180μL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4,50 mmol·L−1)与10μL Tim-3(0.84 mg·mL^(−1))混合,在37°C黑暗孵育1 h后,转移至1×10^(4)超滤离心管中以12000 r·min^(−1)离心10 min,将沉淀加入200μL甲醇-水(90∶10)中室温解离10 min,12000 r·min^(−1)离心10 min,收集滤液,进行UPLC-MS/MS分析。通过比较受试物组和Tim-3蛋白变性组中超滤液中待测物的峰面积,计算各待测物特异结合率。结果经双酶切及测序鉴定证明,人Tim-3-His重组表达质粒构建正确;纯化的人Tim-3重组蛋白质量分数达90%以上;建立的亲和超滤-液质联用筛选体系专属性、精密度、重复性、稳定性良好;白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。结论成功表达了可溶性、高纯度的人Tim-3重组蛋白,成功建立亲和超滤-液质联用筛选体系,白术内酯Ⅰ可与Tim-3蛋白特异性结合。 展开更多
关键词 T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3 重组蛋白 亲和超滤-液质联用 白术内酯Ⅰ
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