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嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质 被引量：4
1
作者 曾静 郭建军 袁林 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第3期98-103,109,共7页
本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶ⅢTk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌... 本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶ⅢTk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的信号肽。结果表明,在信号肽AmyE的引导下,重组Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中高效分泌表达。Tk-PUL属于单结构域双功能酶,同时具有α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性。重组Tk-PUL的α-淀粉酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为54.08 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。重组Tk-PUL的普鲁兰酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为110.39 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。本研究为Tk-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 普鲁兰水解酶ⅲ 双功能酶 枯草芽孢杆菌表达系统 分泌表达 酶学性质
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嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶协同压热制备莲子抗性淀粉的工艺优化及其功能特性研究
2
作者 郭建军 曾静 +1 位作者 王通 袁林 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2024年第11期195-204,共10页
本研究以莲子淀粉为原料,采用嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶(TK-PUL)与压热联合制备RS3型抗性淀粉(EHP-LRS3)。通过单因素实验和响应面试验对TK-PUL与压热联合制备EHP-LRS3的工艺参数进行了优化,采用扫描电子显微镜和X-射线衍射对EHP-LRS3... 本研究以莲子淀粉为原料,采用嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶(TK-PUL)与压热联合制备RS3型抗性淀粉(EHP-LRS3)。通过单因素实验和响应面试验对TK-PUL与压热联合制备EHP-LRS3的工艺参数进行了优化,采用扫描电子显微镜和X-射线衍射对EHP-LRS3的形貌、晶体结构进行了观察与分析,并考察了EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力。结果表明,在TK-PUL酶解温度为80℃时制备EHP-LRS3的最佳工艺为:向质量分数为35.32%的莲子淀粉乳(pH5.00)中添加25.00 U/g(莲子淀粉)的TK-PUL,将混合物于80℃处理12.70 h,再将其依次于121℃压热处理10 min、4℃回生处理24 h。在最佳工艺条件下,EHP-LRS3的得率为58.46%。扫描电镜分析显示EHP-LRS3呈不规则的沟壑状结构。X-射线衍射分析表明EHP-LRS3的晶体结构呈现出不同于莲子淀粉A型晶体结构的B型晶体结构。EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力优于压热法制备的RS3型抗性淀粉(HP-LRS3)。本研究采用TK-PUL与压热联合制备得到高得率的RS3型抗性淀粉(EHP-LRS3),并验证了EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力,为莲子淀粉的高值化利用提供了理论依据。 展开更多
关键词 莲子淀粉 RS3 型抗性淀粉 ⅲ型普鲁兰水解酶 工艺优化 结构特性 长双歧杆菌
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N末端结构模块缺失对嗜热酸性III型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL酶学性质的影响 被引量：2
3
作者 曾静 何础阔 +1 位作者 郭建军 袁林 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第10期201-208,共8页
通过对嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL进行N末端截短突变,并比较TK-PUL与突变酶的酶学性质,确定N末端结构模块的缺失对酶学性质的影响。结构模块N1的缺失改良了TK-PUL的催化特性,其α-淀粉酶比活力提高至TK-PUL的1.11倍,普鲁兰酶... 通过对嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL进行N末端截短突变,并比较TK-PUL与突变酶的酶学性质,确定N末端结构模块的缺失对酶学性质的影响。结构模块N1的缺失改良了TK-PUL的催化特性,其α-淀粉酶比活力提高至TK-PUL的1.11倍,普鲁兰酶比活力提高至TK-PUL的1.12倍,于100℃的半衰期延长至TK-PUL的1.15倍。结构模块N2的缺失提高了酶的热稳定性,于100℃的半衰期延长至TK-PUL的1.25倍。但是结构域N2的缺失降低了酶的pH值稳定性、酶的底物结合能力以及比活力。并且结构域N2影响了酶的底物选择性,导致其α-淀粉酶活性与普鲁兰酶活性的比值由0.49提高至0.60。结果表明,TK-PUL的N末端结构模块N1和N2均不是其发挥催化活性所必需的结构区域,但是对酶的底物结合能力、底物降解能力以及稳定性具有重要影响。 展开更多
关键词 ⅲ型普鲁兰多糖水解酶 N末端结构模块 缺失突变 催化特性
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嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响 被引量：1
4
作者 曾静 何础阔 +3 位作者 郭建军 侯安伟 聂俊辉 袁林 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第22期113-120,共8页
对嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL保守基序中非保守氨基酸残基进行定点突变,通过比较TK-PUL与突变体的酶学性质,确定保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响。TK-PUL保守基序Ⅱ中I500W位点变化不影响其最适反应pH值、pH值稳定性... 对嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶TK-PUL保守基序中非保守氨基酸残基进行定点突变,通过比较TK-PUL与突变体的酶学性质,确定保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响。TK-PUL保守基序Ⅱ中I500W位点变化不影响其最适反应pH值、pH值稳定性、最适反应温度、热稳定性,但使其α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性均明显降低。动力学常数测定结果显示,突变体I500W以麦芽三糖为底物的k_(cat)/K_(m)值基本不变,以异潘糖为底物的k_(cat)/K_(m)值约为TK-PUL的64.78%。结果表明,TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸残基Ile对其水解糖苷键的偏好性起到重要作用。TK-PUL中I500W位点变化不影响其α-1,4-糖苷键水解活性,但使其α-1,6-糖苷键水解活性明显降低。本研究有助于深入理解TK-PUL的双功能催化机制,也可为TK-PUL的分子改造提供理论依据和设计思路。 展开更多
关键词 ⅲ型普鲁兰多糖水解酶 保守基序 定点突变 催化活性 同源模建
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