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人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养 被引量:9
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作者 魏钰 魏民 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第25期4056-4061,共6页
背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养。动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致。如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎... 背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养。动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致。如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键。目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化。方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系。倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定。采用Western blot法检测各代软骨细胞于70%融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达。结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞。第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P <0.01)。结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养。体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降。3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择。 展开更多
关键词 骨关节炎 关节置换 人软骨细胞 一步酶消化法 型胶原酶 型胶原 聚集蛋白聚糖 国家自然科学基金
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替硝唑冲洗液对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响 被引量:4
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作者 张洁 汪黎明 《广东牙病防治》 2010年第6期298-300,共3页
目的探讨龈下刮治同期使用药物冲洗对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响。方法选取100例慢性牙周炎患者,随机分为2组,每组50例。试验组行超声龈下刮治同期0.2%替硝唑冲洗,对照组行单纯超声龈下刮治纯净水冲洗。分别于治疗前及治疗后2周收集... 目的探讨龈下刮治同期使用药物冲洗对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响。方法选取100例慢性牙周炎患者,随机分为2组,每组50例。试验组行超声龈下刮治同期0.2%替硝唑冲洗,对照组行单纯超声龈下刮治纯净水冲洗。分别于治疗前及治疗后2周收集患牙的龈沟液并记录相关的临床指标。采用双抗体夹心酶联免疫法检测龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平。结果 2组患者治疗后患牙牙周临床指标均有明显的改善,治疗后龈沟液中Ⅱ型胶原酶的水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),且试验组较对照组下降幅度更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论超声龈下刮治同期0.2%替硝唑冲洗较单纯超声龈下刮治使龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平降低更显著。 展开更多
关键词 龈沟液 牙周炎 龈下冲洗 型胶原酶 替硝唑
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兔软骨细胞的分离及其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养实验研究 被引量:3
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作者 丛波 张加廷 +4 位作者 韩龙 丁一 徐训安 姚旺林 张仲文 《中国现代医学杂志》 CAS 北大核心 2016年第7期4-8,共5页
目的探讨体外分离兔软骨细胞的方法并观察其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养时的生物活性。方法取4周龄的新西兰大耳兔,处死后在无菌条件下取关节软骨。通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞。倒置相差显微镜下观察软骨细胞特点,制作细胞爬... 目的探讨体外分离兔软骨细胞的方法并观察其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养时的生物活性。方法取4周龄的新西兰大耳兔,处死后在无菌条件下取关节软骨。通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞。倒置相差显微镜下观察软骨细胞特点,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色。将第3代兔软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养,噻唑蓝(MTT)法和糖胺聚糖含量测定法检测软骨细胞在胶原膜上的细胞活性,扫描电镜观察软骨细胞在复合胶原膜上的生长情况。结果分离出的原代软骨细胞初为卵圆形,贴壁后变成三角形或多边形,可被甲苯胺蓝染色。软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上生长良好。结论两部酶法可获得大量软骨细胞,MTT法和扫描电镜证实软骨细胞可在复合胶原膜上正常扩增。 展开更多
关键词 软骨细胞 复合胶原膜 胰蛋白酶 型胶原酶 细胞活性 软骨缺损
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可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白的理化特性研究 被引量:2
4
作者 姜旭淦 陈盛霞 +1 位作者 吴亮 许化溪 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期268-271,共4页
目的研究可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(SCCⅡ)的物理化学特性。方法用光谱法测定吸收峰和等电点,HPLC法检测氨基酸组成,乌氏黏度计测定不同条件下溶液的增比黏度。用SDS-PAGE测定相对分子量(Mr),结合免疫印迹法分析胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜... 目的研究可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(SCCⅡ)的物理化学特性。方法用光谱法测定吸收峰和等电点,HPLC法检测氨基酸组成,乌氏黏度计测定不同条件下溶液的增比黏度。用SDS-PAGE测定相对分子量(Mr),结合免疫印迹法分析胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和Ⅱ型胶原酶作用于SCCⅡ和热变性后的SCCⅡ(D-SCCⅡ)的酶解产物。结果 SDS-PAGE显示SCCⅡ亚基的Mr约为120×103,能与抗SCCⅡ抗体反应;D-SCCⅡ含有10多条免疫印迹呈阳性反应的片段。SCCⅡ溶液的最大吸收峰为230 nm,等电点pH约6.25。氨基酸组成中,Gly、Pro、Glu和Ala含量高,芳香族氨基酸低。SCCⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25~45℃范围内随着温度的升高逐渐下降。在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下SCCⅡ的电泳和免疫印迹图谱无变化,Ⅱ型胶原酶可使SCCⅡ快速水解,胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹阳性条带;D-SCCⅡ经酶解后免疫印迹无阳性条带。结论 SCCⅡ具有独特的物理化学性质,对消化酶有一定抵抗作用,胰蛋白酶作用后可出现多条活性片段。 展开更多
关键词 型胶原蛋白 类风湿关节炎 胰蛋白酶 型胶原酶
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骨痹通方对骨关节炎大鼠基质金属蛋白酶-3和Ⅱ型胶原酶的影响 被引量:3
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作者 杜梦梦 鄢泽然 +2 位作者 陈颖颖 周丽 陶庆文 《中日友好医院学报》 2019年第6期349-353,共5页
目的:以盐酸氨基葡萄糖为阳性对照组,研究骨痹通方调控W nt/p-catenin信号通路影响大鼠膝骨关节炎基质金属蛋白酶-3(M M P-3)、Ⅱ型胶原酶(COL-Ⅱ)的表达的机制。方法:将35只大鼠分为正常组、假手术组、模型组、阳性药物对照组、骨痹通... 目的:以盐酸氨基葡萄糖为阳性对照组,研究骨痹通方调控W nt/p-catenin信号通路影响大鼠膝骨关节炎基质金属蛋白酶-3(M M P-3)、Ⅱ型胶原酶(COL-Ⅱ)的表达的机制。方法:将35只大鼠分为正常组、假手术组、模型组、阳性药物对照组、骨痹通组,每组7只。造模成功后,正常组、假手术组和模型组给予生理盐水灌胃,阳性药物对照组及骨痹通组分别给予盐酸氨基葡萄糖及骨痹通方灌胃治疗。采用Real-time PC R和western blot检测大鼠软骨中Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因和蛋白表达量。结果:骨痹通方组与模型组、阳性药物对照组相比能够显著抑制Wnt5a、β-catenin、M MP-3的基因及蛋白表达(P<0.05),减少COL-Ⅱ的降解(P<0.05)。模型组与正常组相比Wnt5a、β-catenin、MM P-3的基因及蛋白的表达显著增多(P<0.05),COL-Ⅱ的表达显著减少(P<0.05)c结论:骨痹通方能明显抑制Wnt5a、β-Caumiri的表达,从而减少M M P-3的产生、促进C 0L-II的表达,起到保护关节软骨的作用。 展开更多
关键词 骨痹通方 W nt/p-catenin信号通路 骨关节炎 基质金属蛋白酶-3 型胶原酶
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温化方通过NF-κB信号通路调控大鼠膝骨关节炎实验研究 被引量:1
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作者 赵海燕 张鸿婷 +2 位作者 李佳卓 魏明慧 姜芊竹 《陕西中医》 CAS 2022年第6期696-699,共4页
目的:探究温化方调控转录因子κB(NF-κB)信号通路对大鼠膝骨关节炎(KOA)的影响。方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、温化方组、双氯芬酸钠组、抑制剂组,各10只。除对照组外,其余各组大鼠采用弗氏不完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白诱... 目的:探究温化方调控转录因子κB(NF-κB)信号通路对大鼠膝骨关节炎(KOA)的影响。方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、温化方组、双氯芬酸钠组、抑制剂组,各10只。除对照组外,其余各组大鼠采用弗氏不完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白诱导KOA大鼠模型。造模成功后开始给药,模型组给予0.9%氯化钠灌胃,观察组给予温化方灌胃,双氯芬酸钠组给予双氯芬酸钠灌胃,抑制剂组给予NF-κB抑制剂(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)灌胃,对照组大鼠自由饮水和进食。比较各组HE染色情况,大鼠体重、关节炎指数、关节肿胀度变化情况,酶联免疫吸附试验检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平,荧光定量PCR法和Western blot检测大鼠关节滑膜组织中NF-κB信号通路相关基因和蛋白表达水平。结果:与模型组比较,对照组、温化方组、双氯芬酸钠组及抑制剂组的大鼠软骨损伤、纤维增生较低。与模型组比较,对照组、温化方组、双氯芬酸钠组、抑制剂组的大鼠体重较高,关节炎指数、关节肿胀度较低(均P<0.05)。与模型组比较,对照组、温化方组、双氯芬酸钠组、抑制剂组IL-1β、IL-6和TNF-α水平较低(P<0.05)。与模型组比较,对照组、温化方组、双氯芬酸钠组、抑制剂组的NF-κB基因、蛋白表达水平均较低(P<0.05)。结论:温化方通过抑制NF-κB信号通路缓解大鼠KOA病情。 展开更多
关键词 膝骨关节炎 温化方 NF-ΚB信号通路 型胶原蛋白酶 大鼠
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酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞 被引量:2
7
作者 王会仁 袁凤来 +3 位作者 段平国 曹露 李熙雷 董健 《中华创伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1032-1036,共5页
目的采用胶原酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞,与单纯Ⅱ型胶原酶消化法比较培养效果。方法收集腰椎间盘退变患者的髓核组织分为A、B两组进行培养。A组:体积分数0.025%Ⅱ型胶原酶预消化30rain后组织块接种;B组:体积... 目的采用胶原酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞,与单纯Ⅱ型胶原酶消化法比较培养效果。方法收集腰椎间盘退变患者的髓核组织分为A、B两组进行培养。A组:体积分数0.025%Ⅱ型胶原酶预消化30rain后组织块接种;B组:体积分数0.025%Ⅱ型胶原酶消化5h后过滤、离心、接种培养。比较两种方法培养成功率和原代细胞融合时间。HE、甲苯胺蓝、免疫细胞荧光染色法观察细胞形态及Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达。结果A、B两组培养成功率差异无统计学意义(P〉0.05),融合时间A组显著短于B组(P〈0.01)。A组培养的髓核细胞可被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞荧光检测Sox-9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖呈阳性表达。结论与单纯Ⅱ形胶原酶消化法比较,Ⅱ型胶原酶预消化后贴壁培养法培养人退变椎间盘髓核细胞成功率高,短时间内可获大量细胞,且强表达Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。 展开更多
关键词 椎间盘 髓核细胞 细胞培养 免疫荧光技术 型胶原酶
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两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究
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作者 汤小康 李敏 +1 位作者 应航 卢敏 《中国中医急症》 2016年第3期397-399,共3页
目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异。方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25%的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02%Ⅰ型胶原酶和0.... 目的比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异。方法提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25%的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02%Ⅰ型胶原酶和0.02%Ⅱ型胶原酶在37℃消化3次,每次1 h;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异。结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/m L、5.50×104个/m L、6.25×104个/m L,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/m L;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/m L、9.50×104个/m L、8.25×104个/m L,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/m L,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异。3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养。 展开更多
关键词 软骨终板细胞 Ⅰ型胶原酶 型胶原酶 细胞培养
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高纯度大鼠下颌骨来源间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 被引量:1
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作者 程兵坤 梁建飞 +2 位作者 秦东泽 程子绪 赵云转 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2021年第1期67-72,共6页
背景:以募集颌骨来源间充质干细胞来修复颌骨骨缺损这种新观点逐渐被广泛认可,但目前对颌骨来源间充质干细胞的研究相对较少,主要由于颌骨来源间充质干细胞分离困难。目的:建立大鼠下颌骨来源间充质干细胞的体外分离、培养方法,并观察... 背景:以募集颌骨来源间充质干细胞来修复颌骨骨缺损这种新观点逐渐被广泛认可,但目前对颌骨来源间充质干细胞的研究相对较少,主要由于颌骨来源间充质干细胞分离困难。目的:建立大鼠下颌骨来源间充质干细胞的体外分离、培养方法,并观察研究其相关生物学特性。方法:解剖分离大鼠下颌骨,剥离表面附着肌肉后剪碎,用Ⅱ型胶原酶消化疏松密质骨,利用间充质干细胞的迁徙和贴壁生长能力分离下颌骨间充质干细胞。采用倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞表面抗原;MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;成骨、成脂诱导实验研究细胞的多向分化潜能。结果与结论:胶原酶消化骨片培养法分离的细胞阳性表达CD29、CD44、Sca-1,阴性表达CD31、CD34和CD45;细胞增殖能力检测提示下颌骨间充质干细胞生长经历了潜伏期、对数生长期和平台期,具有较强的增殖能力;细胞克隆形成率达20%且处于DNA合成期的细胞占52.5%;成骨、成脂诱导后行茜素红和油红O染色均呈阳性,表明该细胞具有多向分化潜能。结果表明胶原酶消化骨片培养法可从大鼠下颌骨分离足量、高纯度的下颌骨间充质干细胞,且该细胞具有较强的增殖和成骨分化能力,为以种植体骨缺损修复为代表的颌骨骨组织工程提供充足的种子细胞来源。 展开更多
关键词 干细胞 间充质干细胞 下颌骨 型胶原酶 增殖 分化 大鼠
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改良胶原酶消化法分离培养人原代髓核细胞
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作者 李玲慧 龚浩 +4 位作者 陈明 展嘉文 李凯明 朱立国 王尚全 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第6期1011-1014,共4页
目的:优化人原代髓核细胞的体外分离培养方法,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。方法:无菌环境中摘取人椎间盘髓核组织,采用多次胶原酶消化法分离提取原代人髓核细胞,置于5%CO2培养箱中37℃恒温培养,倒置相差显微镜中观察细胞形态,... 目的:优化人原代髓核细胞的体外分离培养方法,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。方法:无菌环境中摘取人椎间盘髓核组织,采用多次胶原酶消化法分离提取原代人髓核细胞,置于5%CO2培养箱中37℃恒温培养,倒置相差显微镜中观察细胞形态,采用MTT法绘制细胞生长曲线,甲苯胺蓝染色法检测髓核细胞内蛋白多糖的表达情况,细胞免疫荧光染色法检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况。结果:本研究中获得的细胞形态不规则,呈梭形或多角形,原代细胞48 h内贴壁,培养第8天左右细胞融合度可达90%,第三代细胞12 h内即可贴壁,生长至融合90%约需5d。甲苯胺蓝染色及细胞免疫荧光染色均阳性,提示所得细胞具有分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白的功能。结论:改良胶原酶消化法可获得大量纯净的人髓核细胞,提高培养效率,原代及传代细胞具备类软骨细胞表型,且活性及功能均较为稳定,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞。 展开更多
关键词 髓核细胞 椎间盘退变 型胶原酶
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人髓核细胞分离、传代培养方法的建立及意义 被引量:2
11
作者 李大鹏 吴燕 +3 位作者 黄永辉 蒋璐 孙继芾 岳佳伟 《山东医药》 CAS 北大核心 2017年第32期1-4,I0001,共5页
目的建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义。方法采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表... 目的建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义。方法采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示),连续检测12天。取第2代NPCs,采用免疫组化法检测Ⅱ型胶原(Col-2)、细胞角蛋白18(KRT-18)、KRT-19、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、Sox-9、聚集蛋白聚糖(ACAN)、CD24阳性表达率。结果分离的NPCs呈多角形或短梭形,类似于软骨细胞;第4代以后,NPCs细胞突起延长,呈长梭形,生长缓慢,出现老化现象。NPCs生长曲线呈S形:1~2天细胞生长缓慢;3~7天细胞生长迅速,进入对数生长期;8天后进入平台期,细胞增殖缓慢。连续培养12天,第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。第2代NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、HIF-1α、GLUT-1、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率均≥85.6%(85.6%~91.2%)。结论单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法及单层贴壁法可分离、培养人NPCs,并经免疫组化染色鉴定证实;传代3代以内的NPCs细胞形态及增殖能力均无明显改变,可作为椎间盘退变相关研究的种子细胞。 展开更多
关键词 髓核细胞 型胶原酶消化法 单层贴壁法 细胞培养 椎间盘退变
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