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基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立
被引量:
4
1
作者
张文燕
王亚文
+5 位作者
袁晨
冯亚文
滕召剑
商佳亮
逯纪成
宋勤叶
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022年第7期2688-2697,共10页
【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/...
【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D_(450 nm)值≥0.365时,判定为阳性;当D_(450 nm)值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。
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关键词
非洲猪瘟病毒(ASFV)
截短
p
72
蛋白
原核表达
间接ELISA
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职称材料
非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较
被引量:
2
2
作者
张文燕
王亚文
+6 位作者
冯亚文
滕召剑
李潭清
董炜
刘涛
宋勤叶
任玉红
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期1182-1191,共10页
比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定...
比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。
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关键词
非洲猪瘟病毒
p
72
蛋白
截短
p
72
蛋白
原核表达
抗原性
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职称材料
题名
基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立
被引量:
4
1
作者
张文燕
王亚文
袁晨
冯亚文
滕召剑
商佳亮
逯纪成
宋勤叶
机构
河北农业大学动物医学院
河北省兽药监察所
保定市动物疫病预防控制中心
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022年第7期2688-2697,共10页
基金
河北省重点研发计划项目“非洲猪瘟病原学和血清学快速检测技术的研究及应用”(21326613D)
河北省高等学校科学技术研究青年项目“非洲猪瘟病毒p72抗体检测ELISA方法的建立”(QN2022046)。
文摘
【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D_(450 nm)值≥0.365时,判定为阳性;当D_(450 nm)值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。
关键词
非洲猪瘟病毒(ASFV)
截短
p
72
蛋白
原核表达
间接ELISA
Keywords
African
swine
fever
virus(ASFV)
truncated
p
72
protein
p
rokaryotic
ex
p
ression
indirect
ELISA
分类号
S855.3 [农业科学—临床兽医学]
下载PDF
职称材料
题名
非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较
被引量:
2
2
作者
张文燕
王亚文
冯亚文
滕召剑
李潭清
董炜
刘涛
宋勤叶
任玉红
机构
河北农业大学动物医学院&河北省兽医生物技术创新中心
河北省兽药监察所
顺平县动物疫病预防与控制中心
瑞普生物药业有限公司
出处
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期1182-1191,共10页
基金
河北省重点研发计划项目(21326613D)。
文摘
比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。
关键词
非洲猪瘟病毒
p
72
蛋白
截短
p
72
蛋白
原核表达
抗原性
Keywords
African
swine
fever
virus
intact/
truncated
p
72
protein
p
rokaryotic
ex
p
ression
antigenicity
分类号
S852.659.1 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立
张文燕
王亚文
袁晨
冯亚文
滕召剑
商佳亮
逯纪成
宋勤叶
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022
4
下载PDF
职称材料
2
非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较
张文燕
王亚文
冯亚文
滕召剑
李潭清
董炜
刘涛
宋勤叶
任玉红
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
2
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