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苜蓿根瘤菌cfp荧光标记株的构建及筛选方法 被引量：4
1
作者 张淑卿 李剑峰 +2 位作者 陈力玉 师尚礼 苗阳阳 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期711-718,共8页
荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Escherichia coli pRK2073,受体菌苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 12531和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5,及cfp青色荧光基因供体菌E.coli... 荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Escherichia coli pRK2073,受体菌苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 12531和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5,及cfp青色荧光基因供体菌E.coli pMP45179为供试菌株,以三亲本杂交法进行结合转导,并以无氮培养基和TY培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测,再对初选菌株以甘农5号紫花苜蓿为宿主进行回接验证,测定了回接植株的生物量,结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明,1)三亲本杂交转导法适用于苜蓿根瘤菌cfp标记菌株的构建,获得大量S.meliloti 12531和R.meliloti GN5的荧光标记株;2)经逐层筛选获得的荧光标记菌中,S.meliloti 12531-cfp6和R.meliloti GNf-cfp5遗传稳定性好,荧光表达量高,结瘤促生能力强;3)与现有抗生素平板分离筛选相比,无氮培养基结合耐药平板筛选能显著提高荧光标记根瘤菌株的甄别筛选效率;4)三亲本杂交法获得的苜蓿根瘤菌荧光标记株个体间差异较大,对标记株固氮及荧光表达能力遗传稳定性的验证和对宿主植物的结瘤促生能力的检测是cfp荧光标记根瘤菌筛选的必要手段。 展开更多
关键词 苜蓿根瘤菌 荧光标记 三亲本杂交 菌种筛选 根瘤
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nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建 被引量：2
2
作者 刘金玲 张喜波 +2 位作者 贾珊珊 平原 李海英 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第1期121-123,129,共4页
以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用... 以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。 展开更多
关键词 大豆根瘤菌 nodD基因 工程菌株 三亲本杂交
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大豆血红蛋白串联基因簇转化根瘤菌工程菌株的构建 被引量：2
3
作者 于海鹏 潘钰 李海英 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2011年第2期233-236,共4页
研究提取大豆根瘤总RNA并将其反转录成cDNA,以其为模板采用同源序列克隆法,利用PCR技术获得大豆血红蛋白基因lbc3、lbc2、lbc1、lba的编码区序列;利用DNA重组技术,将4个血红蛋白基因顺序连接,构建成串联基因簇lbc3-lbc2-lbc1-lba(命名为... 研究提取大豆根瘤总RNA并将其反转录成cDNA,以其为模板采用同源序列克隆法,利用PCR技术获得大豆血红蛋白基因lbc3、lbc2、lbc1、lba的编码区序列;利用DNA重组技术,将4个血红蛋白基因顺序连接,构建成串联基因簇lbc3-lbc2-lbc1-lba(命名为lbX),并构建了lbX的原核表达载体pTR-Plac-lbX;采用三亲本杂交的方法,将原核表达载体pTR-Plac-lbX转化土著大豆根瘤菌,构建转基因根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lbX),为研究转基因工程菌株对大豆根瘤固氮能力的影响奠定基础。 展开更多
关键词 大豆根瘤菌 大豆血红蛋白基因 串联基因簇 DNA重组技术 三亲本杂交
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EYFP基因导入大豆根瘤菌工程菌株的构建
4
作者 张先成 甄涛 +2 位作者 于盛竹 曲娟娟 于德水 《黑龙江科学》 2016年第18期8-9,共2页
将黄色荧光蛋白基因(EY FP)整合到质粒p B B R 1M C S-2上,构建p B B R 1M C S-2-EY FP,通过三亲本杂交的方法,将构建的载体转化到H W-05中,获得含有黄色荧光蛋白的根瘤菌菌株。
关键词 荧光蛋白基因 大豆根瘤菌 三亲本杂交
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导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建
5
作者 蒙明明 于冰 +1 位作者 李珊珊 李海英 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第3期391-394,400,共5页
为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重... 为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。 展开更多
关键词 如以基因 转基因工程菌株 三亲本接合转移
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基因工程菌株nifDK基因敲除
6
作者 甄涛 张先成 于德水 《黑龙江科学》 2016年第17期9-10,共2页
以慢生型大豆根瘤菌(B radyrhizobium japonicum)H W-05的基因组D N A作为模板,PC R扩增固氮酶基因nif D K上下游片段,融合后与p K18m obsac B载体相连。采用三亲本杂交的方法,将构建的载体转化到慢生大豆根瘤菌中,构建此工程菌株为研... 以慢生型大豆根瘤菌(B radyrhizobium japonicum)H W-05的基因组D N A作为模板,PC R扩增固氮酶基因nif D K上下游片段,融合后与p K18m obsac B载体相连。采用三亲本杂交的方法,将构建的载体转化到慢生大豆根瘤菌中,构建此工程菌株为研究大豆的固氮能力奠定了基础。 展开更多
关键词 大豆根瘤菌 固氮酶基因 三亲本杂交
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导入额外拷贝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的构建
7
作者 李海英 张喜波 +4 位作者 刘金玲 于海鹏 杨乐 蒙明明 贾珊珊 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第6期744-746,共3页
以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA为模板,采用PCR技术,克隆固氮基因nifA全长;将其连入带有lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的表达载体pTR102,采用三亲本杂交技术转化土著大豆根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工... 以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA为模板,采用PCR技术,克隆固氮基因nifA全长;将其连入带有lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的表达载体pTR102,采用三亲本杂交技术转化土著大豆根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。为研究转基因工程菌株对大豆固氮能力的影响奠定基础。 展开更多
关键词 大豆根瘤菌 NIFA基因 三亲本杂交 大豆根瘤菌工程菌株
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导入nodD-lba串联基因的根瘤菌工程菌株的构建 被引量：2
8
作者 李珊珊 李海英 于冰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期119-123,共5页
旨在利用同源序列克隆法,克隆出结瘤相关基因nodD和大豆血红蛋白基因lba。以串联的方式将nodD和lba基因连接到lac启动子的下游,通过DNA重组技术构建出带有发光酶基因luxAB的重组载体pTR-Plac-nodD-lba。通过三亲本杂交方法构建转基因费... 旨在利用同源序列克隆法,克隆出结瘤相关基因nodD和大豆血红蛋白基因lba。以串联的方式将nodD和lba基因连接到lac启动子的下游,通过DNA重组技术构建出带有发光酶基因luxAB的重组载体pTR-Plac-nodD-lba。通过三亲本杂交方法构建转基因费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii),Western blot试验证明导入基因能够进行表达。将初始菌株和基因工程菌株侵染大豆幼苗后进行固氮酶活的测定。测定结果表明,转基因工程菌株均能够提高固氮酶效率,导入串联基因的工程菌株在提高固氮酶活性上比导入lba和nodD基因的工程菌株高出4%和15.1%。 展开更多
关键词 结瘤基因nodD 大豆血红蛋白基因lba 费氏中华根瘤菌 三亲本杂交
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大豆血红蛋白基因lba转化根瘤菌工程菌株的构建 被引量：2
9
作者 于海鹏 潘钰 +1 位作者 蒙明明 李海英 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期69-74,共6页
以土著大豆根瘤菌接种大豆幼苗45 d后获得的根瘤为材料,提取其总RNA并反转录成cDNA,采用同源序列克隆法扩增大豆血红蛋白基因lba编码区序列。利用DNA重组技术,将lba基因连到lac启动子的下游,利用带有发光酶标记基因luxAB的质粒载体pTR10... 以土著大豆根瘤菌接种大豆幼苗45 d后获得的根瘤为材料,提取其总RNA并反转录成cDNA,采用同源序列克隆法扩增大豆血红蛋白基因lba编码区序列。利用DNA重组技术,将lba基因连到lac启动子的下游,利用带有发光酶标记基因luxAB的质粒载体pTR102构建表达载体pTR-Plac-lba。采用三亲本杂交的方式,将表达载体pTR-Plac-lba及作为对照的空载体pTR102分别转化土著大豆根瘤菌,获得根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lba)和SFH(pTR102)。盆栽试验发现,接种SFH(pTR-Plac-lba)的大豆植株各生理指标明显高于接种SFH(pTR102)、土著根瘤菌以及未接菌的大豆植株各生理指标。试验证明,导入大豆血红蛋白基因lba的根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lba)对于提高大豆根瘤的固氮酶活性,增加大豆产量起到显著效果。 展开更多
关键词 土著大豆根瘤菌 大豆血红蛋白基因lba DNA重组技术 工程菌株 三亲本杂交
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