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GH42家族保守氨基酸位点累积突变对Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响
1
作者 董艺凝 陈卫 +3 位作者 张灏 顾海洋 刘洋 陈海琴 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2532-2544,共13页
【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-... 【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响。【方法】在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303与F341进行累积突变。【结果】与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为30%;GOS最大得率由0.75%提高到19.50%。【结论】家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性。 展开更多
关键词 Β-半乳糖苷酶 累积突变 低聚半乳糖 GH42糖苷水解酶家族 转糖苷催化活性
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不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响
2
作者 闫明奎 潘爱珍 +3 位作者 王超萍 司振军 衣田甜 马玲琪 《中国酿造》 CAS 北大核心 2010年第8期100-104,共5页
在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵产转糖基β-半乳糖苷酶过程中,以单因素试验为基础研究了不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响,利用Mintab15软件响应面分析法优化在转糖基β-半乳糖苷酶活性最大时的最佳... 在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵产转糖基β-半乳糖苷酶过程中,以单因素试验为基础研究了不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响,利用Mintab15软件响应面分析法优化在转糖基β-半乳糖苷酶活性最大时的最佳金属离子浓度、表面活性剂的添加量及加入时机。结果表明,发酵培养基中镁离子浓度为0.031%,吐温-80添加量为0.24%,钾离子浓度为0.047%时,最有利于提高转糖基β-半乳糖苷酶的活性且酶的活性最大。为保持产酶过程中β-半乳糖苷酶的最大活性,在菌体生长对数期的初期,OD值为1.6时添加0.2%的吐温-80,添加过早或过晚都会影响转糖基β-半乳糖苷酶的活性。 展开更多
关键词 金属离子 表面活性剂 转糖基β-半乳糖苷酶 酶活性
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地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用 被引量：6
3
作者 史然 张登娅 +2 位作者 谷懿寰 江正强 杨绍青 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第18期135-142,共8页
对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造,以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库,筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶(mPbFuc29A1)... 对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造,以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库,筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶(mPbFuc29A1)。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40℃,最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5℃;突变酶水解2’-FL的比活力提高到3倍,但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷(4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside,pNP-FUC)和3’-岩藻糖基乳糖(3’-fucosyllactose,3’-FL)的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物,采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL,转化率分别为23.6%和56.4%,其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2个位点发生突变(Asp21Val和Glu266Lys),其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。 展开更多
关键词 Α-L-岩藻糖苷酶 定向进化 底物特异性 转糖苷活性 2’-岩藻糖基乳糖
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长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质
4
作者 项蓉 杨金山 +6 位作者 娄婷婷 吴子健 张宏宇 赵彦巧 王丹芸 张得光 马兴 《食品研究与开发》 CAS 2024年第5期196-204,共9页
为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表... 为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷(isopropylthio⁃β⁃D⁃galactoside,IPTG)浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到(730.35±0.58)U/mL,比酶活达到(95.22±2.45)U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为(266.80±23.76)mmol/L,Vmax值为(0.2350±0.0099)mmol/(L·min)。 展开更多
关键词 蔗糖磷酸化酶 大肠杆菌 异源表达 转糖基化活力 酶学性质
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传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件 被引量：4
5
作者 王丽军 牟元珍 +4 位作者 关波 万丽云 张艳 胡有贞 倪永清 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第22期88-95,共8页
分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的MRS培养基筛选平板进行初筛,... 分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L.plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。 展开更多
关键词 Β-半乳糖苷酶 转糖基活性 低聚半乳糖 植物乳杆菌 奶酪
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驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析 被引量：3
6
作者 韩明明 褚宇欣 +3 位作者 关波 胡有贞 李谞 倪永清 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第24期74-83,共10页
分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,GOS)提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基(MRS)进行初级分离筛选,以产酶菌株粗... 分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,GOS)提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基(MRS)进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2 g/100 mL乳糖、1 g/100 mL氮源(蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉)及初始pH 5.5的条件下,37℃培养20 h,产酶水平最高可达(3.81±0.02)U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45~70℃均能保持50%以上相对酶活力。以45 g/100 mL乳糖为底物,该酶在65℃、pH 7.0条件下,反应4 h生成转移二糖的得率为13.51%(m/m,下同),转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。 展开更多
关键词 Β-半乳糖苷酶 低聚半乳糖 转糖基反应 开菲尔乳杆菌 酶学特性
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新疆回民自制酸泡菜中产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株的筛选和鉴定 被引量：1
7
作者 张宇洁 王丽军 +2 位作者 关波 倪永清 何顺 《安徽农业科学》 CAS 2018年第25期159-161,178,共4页
[目的]通过可培养的方式从泡菜中分离和筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶(β-gal)的菌株。[方法]以乳糖为唯一碳源,Ca CO3溶钙圈和添加X-Gal的MRS筛选平板进行初筛,再通过o NPG法测定菌株β-gal活性进行复筛,最后以粗酶液催化乳糖进行转... [目的]通过可培养的方式从泡菜中分离和筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶(β-gal)的菌株。[方法]以乳糖为唯一碳源,Ca CO3溶钙圈和添加X-Gal的MRS筛选平板进行初筛,再通过o NPG法测定菌株β-gal活性进行复筛,最后以粗酶液催化乳糖进行转糖基反应,通过TLC分析确认转糖基活性。[结果]通过3级筛选,得到具有转糖基活性β-gal的菌株6株。结合其形态学、生理生化特征及16S r DNA序列同源性分析,确定筛选获得产转糖基活性β-gal菌株中,5株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),1株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。[结论]该研究可为以乳糖为底物高效合成功能性的低聚半乳糖提供新的酶源。 展开更多
关键词 泡菜 Β-半乳糖苷酶 转糖基活性 乳酸杆菌 系统发育
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转糖基β-半乳糖苷酶产生菌Enterobacter agglomerans B1:筛选鉴定、发酵产酶及其合成低聚半乳糖的研究 被引量：14
8
作者 卢丽丽 肖敏 徐晓东 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期38-44,共7页
从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶... 从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化。最佳培养基主要组份为:乳糖1%,酵母粉1%,蛋白胨0.5%;发酵条件为:初始pH7.5,发酵温度25℃,发酵时间26h。在该培养条件下产酶量为9.7U/mL。利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为:pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液;50℃反应12h。最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析,确定低聚半乳糖产量为40.7%,组分为转移二糖、三糖和四糖。 展开更多
关键词 成团肠杆菌 鉴定 转糖基β-半乳糖苷酶 发酵条件 低聚半乳糖
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