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含人组织激肽释放酶1和基质金属蛋白酶组织抑制物1基因共表达载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 被引量：3
1
作者 朱鹏立 余惠珍 +5 位作者 黄舒洁 向红 张枫 潘玮 李峰 林帆 《中华高血压杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1066-1072,共7页
背景和目的前期研究表明人组织激肽释放酶1（hTK1）基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了。本研究构建含双基因... 背景和目的前期研究表明人组织激肽释放酶1（hTK1）基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了。本研究构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠VSMC中的表达,以及对VSMC生长增殖影响。方法采用限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ,酶切含启动子CMV和hTIMP1基因片段的重组穿梭质粒,经PCR、连接、热激、转化等亚克隆至pDC316-hTK1质粒中,构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组穿梭质粒。将骨架质粒和穿梭质粒于293A细胞包装重组腺病毒载体。感染大鼠VSMC后,采用RealtimePCR法、Western blot法检测目的基因转录、蛋白表达。细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定细胞增殖。结果经PCR、酶切和测序法证实,含双基因（hTK1和hTIMP1）的重组病毒穿梭质构建正确。在293A细胞中成功包装出重组腺病毒载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染VSMC后,双基因（hTK1和hTIMP1）的转录水平表达呈现随感染复数（50~150 MOI）和时间（1~3d）依赖性地增加,目的蛋白（hTK1和hTIMP1）亦呈现浓度依赖性地高表达。与单基因载体（Ad-hTK1或Ad-hTIMP1）相比较,双基因载体可明显抑制血小板源性生长因子（PDGF）诱导的大鼠VSMC增殖（P〈0.01）,其峰值抑制率为45.7%。结论首次成功构建并包装重组腺病毒双基因载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染细胞后,其目的基因和蛋白均呈现独立高表达,并具有协同抑制VSMC增殖的效应,为血管增殖性疾病的多基因干预治疗实验提供一个新工具。 展开更多
关键词 人组织激肽释放酶1 人基质金属蛋白酶组织抑制物1 重组腺病毒载体 血管平滑肌细胞 基因表达 细胞增殖
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人组织激肽释放酶基因重组腺病毒转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响 被引量：2
2
作者 谢良地 余惠珍 +3 位作者 朱鹏立 许昌声 王华军 李体远 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期662-668,共7页
目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP... 目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP)标志基因和目的基因hKLK1;用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移。结果:(1)hKLK1基因转移呈感染复数依赖性(20-100MOI)抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR生长,100MOI时抑制率为39.3%;呈时间依赖性抑制VSMCSHR生长,第5d时达高峰,抑制率为35.2%。(2)hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,峰值抑制率为30.2%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCSHR明显增多,最大阻滞率为36.4%(P<0.01),而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140逆转了hKLK的抑制作用。(3)hKLK1基因转移明显上调PDGF-BB诱导VSMCSHR的p27Kip1、p21Cip1表达,Hoe140明显降低p27Kip1、p21Cip1表达。(4)hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140不影响该抑制作用。结论:hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCSHR迁移效应可能不通过B2受体。 展开更多
关键词 组织激肽释放酶1 基因转移 细胞增殖 细胞迁移 血管平滑肌细胞
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人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响 被引量：2
3
作者 余惠珍 谢良地 +1 位作者 朱鹏立 许昌声 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期746-749,共4页
目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重... 目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重组腺病毒载体。采用组织贴块法培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,接种第3～6代VSMCSHR于6孔板,分别加入含hKLK1重组腺病毒和对照病毒干预,3d后加入PDGF-BB诱导24h,采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移,并加入缓激肽受体B2特异性阻断剂Hoe140。RT-PCR法测定缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达。结果hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140干预不产生影响。PDGF-BB诱导的VSMCSHR缓激肽B2受体mRNA表达明显增加(P<0.001),而Hoe140可明显降低其表达(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR迁移,这一效应可能不通过B2受体途径介导。 展开更多
关键词 人组织激肽释放酶1 基因转移 血管平滑肌细胞 细胞迁移 缓激肽受体
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TK1和TIMP1基因共表达载体的构建及其在大鼠血管平滑肌细胞中的表达 被引量：1
4
作者 余惠珍 向红 +3 位作者 黄舒洁 朱鹏立 潘玮 张枫 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1072-1078,共7页
目的构建含人组织激肽释放酶1(hTK1)和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP1)基因的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达。方法选择相对应酶切位点,酶切含人TIMP1基因片段的原始质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316,经连接... 目的构建含人组织激肽释放酶1(hTK1)和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP1)基因的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达。方法选择相对应酶切位点,酶切含人TIMP1基因片段的原始质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316,经连接、热激、转化等亚克隆而构建成重组穿梭质粒。之后,应用限制性内切酶BglⅡ/SalⅠ,酶切含启动子和hTIMP1基因片段,再通过回收片段以及连接、热激等步骤亚克隆至pDC316-hTK1载体中,构建含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组病毒穿梭质粒。利用AdMax腺病毒Cre/loxP重组酶系统,将该质粒和骨架病毒质粒于293A细胞中同源重组包装产生双基因的重组腺病毒载体。采用Western blot测定在VSMCs中的表达。结果经PCR、双酶切和测序证实,重组病毒穿梭质粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1构建正确。在293A细胞里成功包装产生含双基因的重组腺病毒载体Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,hTK1和hTIMP1蛋白呈独立高表达,表达水平呈浓度依赖性增加。结论首次成功构建并包装了含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组腺病毒载体,目的蛋白在VSMCs中呈现独立高表达。 展开更多
关键词 组织激肽释放酶1基因 基质金属蛋白酶组织抑制物1基因 重组腺病毒载体 血管重构
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