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Sirt1基因稳定低表达的LMH细胞系构建
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作者 郁建锋 胡悦 +4 位作者 付修虎 王中亮 徐璐 龚道清 顾志良 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2019年第2期76-82,共7页
为构建Sirtl基因低表达的LMH细胞系,根据鸡Sirtl基因的3′UTR序列设计gSmiR30、gSmiR70和gSmiR913个miRNAs,以质粒pLNCX-gSmiRn(n为30,70或91)分别过表达这3个miRNAs48h后,依次检测其对CHO-K1细胞中报告载体psiCHECH2-gSirtl-UTR672所... 为构建Sirtl基因低表达的LMH细胞系,根据鸡Sirtl基因的3′UTR序列设计gSmiR30、gSmiR70和gSmiR913个miRNAs,以质粒pLNCX-gSmiRn(n为30,70或91)分别过表达这3个miRNAs48h后,依次检测其对CHO-K1细胞中报告载体psiCHECH2-gSirtl-UTR672所表达的荧光素酶活性的影响以及对LMH细胞中Sirtl基因表达的干扰情况;然后选用干扰效果较好的pLNCX-gSmiR30包装的反转录病毒感染LMH细胞,以终浓度1μg·mL^-1的G418筛选稳定过表达gSmiR30的LMH-gSmiR30细胞系,荧光定量PCR和Westernblot检测Sirtl基因的表达。结果表明:人工设计的3个miRNAs可抑制含靶位点的海肾荧光素酶活性在97%以上;且LMH细胞中Sirtl的mRNA表达水平均能被这3个miRNAs下调40%以上;筛选得到的LMH-gSmiR30细胞中绿色荧光蛋白的表达率在99%以上,细胞内Sirt1基因的mRNA水平下降75%,SIRT1蛋白也明显减少。这一研究成功获得了Sirt1基因低表达的LMH-gSmiR30细胞系,为进一步研究Sirt1基因在鸡肝脏中的功能提供了一种很好的细胞模型。 展开更多
关键词 鸡 Sirt1基因 肝脏 反转录病毒 LMH-gSmiR30细胞系
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蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体构建与检测 被引量：1
2
作者 安铁洙 宁方勇 +2 位作者 王春生 朴善花 梁洋 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期64-68,共5页
利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP。采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒。通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR... 利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP。采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒。通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况。结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中。 展开更多
关键词 蜘蛛拖丝蛋白基因 逆转录病毒载体 重组逆转录病毒
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