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短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用 被引量：7
1
作者 王超 贺婷婷 +2 位作者 宋婷 张长斌 王海燕 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期1083-1088,共6页
短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢... 短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础. 展开更多
关键词 短小芽孢杆菌 高渗透压电转化法 温度敏感性质粒 基因敲除
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γ干扰素工程菌发酵工艺研究 被引量：2
2
作者 张涛铸 谢幸殊 +1 位作者 张嗣良 叶勤 《华东化工学院学报》 CSCD 1993年第2期153-158,共6页
在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基... 在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基质的恒化培养,得出了工程菌细胞生长得率与比生长速率之间的关系,同时表明工程菌升温表达前的比生长速率对表达后干扰素的比活有影响,比生长速率在0.10～0.15h^(-1)时比活最大。通过碳、氮、镁的间歇流加培养与连续流加培养,均使工程菌达到高密度与高表达,但以控制比生长速率为目的的连续流加培养较间歇流加比活提高近4倍,棕1.1×10^(10)IU/L。 展开更多
关键词 干扰素 发酵
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苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析
3
作者 罗春平 李俊花 +2 位作者 徐子雅 彭东海 阮丽芳 《氨基酸和生物资源》 CAS 2014年第1期60-65,共6页
对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基... 对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。 展开更多
关键词 苏云金素 非核糖体肽合成酶 基因敲除 温敏型质粒
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基因局部改组技术在ubiA基因突变中的应用
4
作者 顾超 傅楠 +1 位作者 叶江 张惠展 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期532-537,共6页
辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)作为线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术及应用价值。由ubiA基因编码的4-羟苯甲酸聚异戊二烯转移酶(UbiA)是大肠杆菌CoQ生物合成途径的限速步骤,但通过系统突变对其结构进行研究鲜有报道。【目的】应用化学合... 辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)作为线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术及应用价值。由ubiA基因编码的4-羟苯甲酸聚异戊二烯转移酶(UbiA)是大肠杆菌CoQ生物合成途径的限速步骤,但通过系统突变对其结构进行研究鲜有报道。【目的】应用化学合成的随机序列寡核苷酸,对ubiA基因编码活性区域的DNA序列进行随机突变。【方法】以大肠杆菌MC4100的ubiA基因插入灭活突变株为受体,将化学合成的随机序列替换目标区域序列,进行ubiA基因的局部改组;最终对所得突变株的ubiA改组基因的突变序列及其功能进行对应分析。【结果】ubiA基因局部改组后经过两轮筛选,得到CoQ产量发生不同程度变化的7株ubiA基因突变株,与野生型ubiA相比改组型ubiA的编码序列呈显著变化,其测序结果从一个侧面证实了文献报道的3个天冬氨酸位点与ubiA基因所编码蛋白的催化活性之间的关系。【结论】本文建立的基因局部改组技术是可行的;利用该技术初步揭示了UbiA中对其活性具有重要贡献的部分氨基酸位点。 展开更多
关键词 ubiA基因 辅酶Q 基因局部改组 温敏质粒
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一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法 被引量：2
5
作者 姜娜 王艳春 +2 位作者 马志宏 罗琳 刘纯杰 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期85-89,共5页
基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载... 基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在DNA水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。 展开更多
关键词 伤寒沙门氏菌 温敏质粒 λRed重组系统 ssaV 基因敲除
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