三萜皂苷合成生物学元件的初步开发:三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析 被引量：31

1

作者 牛云云 朱孝轩 +3 位作者 罗红梅 孙超 黄林芳 陈士林 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期211-218,共8页

中药合成生物学是将合成生物学思路引入中药天然产物次生代谢途径研究的一门新兴学科,其发展初期的首要任务是进行元件的开发与标准化,建立标准化的合成生物学元件库。三七(Panax notoginseng)作为人参属重要的药用植物,具有较高的药用... 中药合成生物学是将合成生物学思路引入中药天然产物次生代谢途径研究的一门新兴学科,其发展初期的首要任务是进行元件的开发与标准化,建立标准化的合成生物学元件库。三七(Panax notoginseng)作为人参属重要的药用植物,具有较高的药用价值,其主要活性成分是三萜皂苷。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase)被认为是三萜皂苷与植物甾醇次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜皂苷合成生物学研究的重要元件之一。本研究克隆获得三七中两种类型的鲨烯环氧酶编码基因(PnSE1、PnSE2),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测其在4年生三七不同组织部位的表达模式,以及受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理后基因的表达量变化,为实现中药合成生物学元件挖掘与开发奠定基础。PnSE1基因与PnSE2基因预测编码蛋白分别包含537和545个氨基酸,序列相似性为79%,但N端(前70个氨基酸)序列不保守。PnSE1基因在根、茎、叶、花中均有表达,以花中表达丰度最高;PnSE2基因只在花中表达量显著,其余组织较弱。PnSE1基因响应MeJA诱导,诱导24 h后在叶中的表达量最大;相同诱导条件下,PnSE2基因未响应诱导,表达水平无显著变化。结果表明,PnSE1和PnSE2基因具有不同的表达模式,在三七次生代谢产物合成中起不同催化作用,推测PnSE1基因参与三萜皂苷合成途径,PnSE2基因则在甾醇合成途径中起催化作用。 展开更多

关键词 合成生物学 三七 鲨烯环氧酶 三萜皂苷 基因表达

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刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析 被引量：18

2

作者 邢朝斌 曹蕾 +3 位作者 陈龙 何闪 李宝财 朱金丽 《中国中药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期172-175,共4页

目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析。方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列。结果:克隆了2个序列不同的cDNA(... 目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析。方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列。结果:克隆了2个序列不同的cDNA(SE1和SE2),开放阅读框分别长1 665,1 629 bp,分别编码554,542个氨基酸。SE1,SE2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为91.49%,92.55%,两者与三七SE1的氨基酸序列相似性最高,分别为93.45%,94.87%。SE1,SE2均含有1个FAD结合区域,SE1,SE2推测的氨基酸分别存在2个和4个跨膜螺旋。结论:首次分离并报道了刺五加的2个SE基因cDNA序列,为刺五加的次生代谢工程研究奠定了基础。 展开更多

关键词 刺五加 鲨烯环氧酶基因 克隆 RT-PCR

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鲨烯环氧酶基因的克隆及其在人参根组织中的表达 被引量：9

3

作者 刘宁 田玉华 +2 位作者 孟星宇 张连学 胡薇 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期40-45,共6页

对人参根组织中的鲨烯环氧酶基因进行了克隆与序列分析,并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测了鲨烯环氧酶基因不同年生人参根组织中的表达水平。结果表明:克隆人参根中鲨烯环氧酶基因全长编码区cDNA为1 611 bp,编码537aa长的多肽,其... 对人参根组织中的鲨烯环氧酶基因进行了克隆与序列分析,并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测了鲨烯环氧酶基因不同年生人参根组织中的表达水平。结果表明:克隆人参根中鲨烯环氧酶基因全长编码区cDNA为1 611 bp,编码537aa长的多肽,其核苷酸和氨基酸序列与GenBank中人参鲨烯环氧酶基因序列(登录号:AB122078.1)对比,同源性分别为99.75%和99.81%。相对荧光定量PCR差异分析发现鲨烯环氧酶基因在一年、三年、四年、五年生人参根组织中均有表达,其中在五年生人参根中表达水平最高。 展开更多

关键词 人参 鲨烯环氧酶基因 CDNA克隆 差异表达

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野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达 被引量：8

4

作者 王宝婕 朱灵英 +3 位作者 周青青 张帅 马晓惠 徐福荣 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第22期147-153,共7页

目的:对野三七中可能参与三萜皂苷合成的关键酶鲨烯环氧酶基因(Pvf SE)进行克隆,并对其进行生物信息学分析和原核表达。方法:采用Trizol法提取野三七根的总RNA并反转录为c DNA第一链,基于野三七的转录组数据,设计Pvf SE基因序列特异性引... 目的:对野三七中可能参与三萜皂苷合成的关键酶鲨烯环氧酶基因(Pvf SE)进行克隆,并对其进行生物信息学分析和原核表达。方法:采用Trizol法提取野三七根的总RNA并反转录为c DNA第一链,基于野三七的转录组数据,设计Pvf SE基因序列特异性引物,克隆基因全长,利用相关软件对该基因进行生物信息学分析,构建p Mal-c2X-Pvf SE原核表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达重组蛋白。结果:Pvf SE开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,蛋白相对分子质量为68. 8 k Da,理论等电点为9. 28,脂肪系数为95. 18,亲水性系数为-0. 060,不稳定指数为40. 36,属于不稳定蛋白。生物信息学分析表明,Pvf SE具有2个跨膜结构域,无信号肽,可能定位在叶绿体或细胞质膜上,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,属于混合型蛋白。Pvf SE与西葫芦和芒柄花中参与三萜皂苷合成的鲨烯环化酶(Cp SE1,Cp SE3,Os SE1,Os SE2)亲缘关系较近。此外,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达Pvf SE的重组蛋白。结论:克隆得到Pvf SE基因,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步研究Pvf SE的功能和解析野三七中三萜皂苷生物合成途径奠定了基础。 展开更多

关键词 野三七 鲨烯环氧酶 基因克隆 生物信息学分析 原核表达

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滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究 被引量：8

5

作者 许燕 赵爽 +1 位作者 董栩 叶鑫 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1839-1844,共6页

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RN... 目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。 展开更多

关键词 滇重楼 鲨烯环氧酶 基因克隆 原核表达 荧光定量PCR

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桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析 被引量：7

6

作者 孙婷婷 邹莉 +3 位作者 张林芳 张国权 杨苑艺 李晶莹 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2015年第18期2768-2773,共6页

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)进行基因全长克隆和生物信息学分析。方法以桑黄总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆桑黄SE基因的全长c DNA和DNA序列,并通过Ex PASy在线分析等方法对其进行生... 目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)进行基因全长克隆和生物信息学分析。方法以桑黄总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆桑黄SE基因的全长c DNA和DNA序列,并通过Ex PASy在线分析等方法对其进行生物信息学分析。结果序列分析表明,SE基因全长2 145 bp,包含6个外显子和5个内含子;所克隆的c DNA全长为1 856 bp,包含1个1 452 bp的开放阅读框,编码483个氨基酸的蛋白,命名为Ib SE1,预测该蛋白的相对分子质量为5.3×104,等电点(p I)为8.41,无信号肽。结论首次克隆并获得桑黄鲨烯环氧酶基因全长序列,为进一步阐明桑黄三萜代谢途径和改善中药材品质奠定基础。 展开更多

关键词 桑黄 鲨烯环氧酶 RACE 基因克隆 序列分析

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橘核柠檬苦素类化合物积累与功能基因表达的灰色关联度分析 被引量：5

7

作者 王黎 罗静 +3 位作者 裴瑾 王倩 吴沂芸 焦梅英 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期345-350,共6页

目的研究橘核传统药用品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’中柠檬苦素类化合物生物合成机制与转运规律。方法利用UPLC法测定橘种子生长发育过程中茎、叶、果皮及种子中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮等柠檬苦素类化合物的量,采用灰... 目的研究橘核传统药用品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’中柠檬苦素类化合物生物合成机制与转运规律。方法利用UPLC法测定橘种子生长发育过程中茎、叶、果皮及种子中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮等柠檬苦素类化合物的量,采用灰色关联度分析方法,与克隆获得的角鲨烯合成酶基因(ss)、角鲨烯环氧酶基因(se)、葡萄糖基转移酶基因(lgt)表达量进行关联度分析。结果不同器官中柠檬苦素类化合物在种子中得到最大积累;不同器官中柠檬苦素类化合物的积累与ss、se、lgt基因表达均有较大的关联,但在种子中柠檬苦素的积累与ss、se、lgt基因表达最密切,其中ss基因表达对柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的积累贡献最大。结论本实验为柠檬苦素类化合物合成机制与转运规律提供可靠、科学的依据。 展开更多

关键词 橘核 柠檬苦素类化合物 功能基因 灰色关联度分析 角鲨烯合成酶基因 角鲨烯环氧酶基因 葡萄糖基转移酶基因

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药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展 被引量：5

8

作者 许燕 赵爽 邸亮 《安徽医药》 CAS 2016年第3期417-420,共4页

鲨烯环氧酶(SE)存在于内质网的微粒体中,在鲨烯转变为环氧化鲨烯的生物过程中作为生物催化剂起催化作用。而环氧化鲨烯是从鲨烯生成环阿屯醇、香树素、羊毛甾醇等的过程中重要的中间产物。SE的活性决定了环氧化鲨烯的生物合成的效率,继... 鲨烯环氧酶(SE)存在于内质网的微粒体中,在鲨烯转变为环氧化鲨烯的生物过程中作为生物催化剂起催化作用。而环氧化鲨烯是从鲨烯生成环阿屯醇、香树素、羊毛甾醇等的过程中重要的中间产物。SE的活性决定了环氧化鲨烯的生物合成的效率,继而,以环氧化鲨烯作为前体的各类甾体皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也随之受其影响,后续产物的产量取决于它的含量和活性。因此SE被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控酶,已在多种植物中克隆出并进行了初步功能鉴定。该文概述几个重要药用植物的SE基因的克隆及原核表达,为从其他药用植物中克隆SE基因提供一定的参考依据及方法思路。 展开更多

关键词 鲨烯环氧酶 基因克隆 原核表达

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龙牙楤木SE基因克隆与植物表达载体构建 被引量：4

9

作者 成慧 杨光 +3 位作者 刘雅婧 赵春彦 原亚萍 吴颖 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期47-50,共4页

采用RT-PCR的方法,从龙牙楤木中克隆到鲨烯环氧酶(SE)基因,该基因的cDNA全长为1 682 bp,含有1 644 bp的开放阅读框(ORF),编码547个氨基酸,将所得的序列提交GenBank数据库,登录号为GU354314。序列分析结果表明:龙牙楤木SE基因的氨基酸序... 采用RT-PCR的方法,从龙牙楤木中克隆到鲨烯环氧酶(SE)基因,该基因的cDNA全长为1 682 bp,含有1 644 bp的开放阅读框(ORF),编码547个氨基酸,将所得的序列提交GenBank数据库,登录号为GU354314。序列分析结果表明:龙牙楤木SE基因的氨基酸序列与人参、三七、绞股蓝的同源性>90%,并构建了该基因的植物表达载体pAeSE。 展开更多

关键词 龙牙楤木 鲨烯环氧酶(SE)基因 植物表达载体 三萜皂苷

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金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达 被引量：4

10

作者 李国栋 韩丽君 +2 位作者 刘小莉 杨耀文 钱子刚 《中药材》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期2210-2216,共7页

目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个... 目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长c DNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量。结果:得到2条SE c DNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了p EASY-E1-SE-1及p EASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶。结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。 展开更多

关键词 金铁锁 鲨烯环氧酶 克隆 基因表达 生物信息学分析

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竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆及生物信息学分析

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作者 李鹏飞 黄朝康 +5 位作者 杨小林 牛腾飞 陈军峰 赵淑娟 王峥涛 王如锋 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1917-1923,共7页

目的克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因(squalene epoxidase,PjSE)的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学... 目的克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因(squalene epoxidase,PjSE)的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学分析工具进行序列分析;构建重组原核表达载体pCold-PjSE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在竹节参不同组织中的相对表达量。结果PjSE基因开放阅读框长度为1884 bp,编码627个氨基酸,PjSE蛋白相对分子质量为68639.49,初步预测其具有跨膜结构域,可能定位在叶绿体上;聚丙烯凝胶电泳结果显示诱导表达蛋白的相对分子质量大小与预期结果一致;该基因在竹节参叶中表达量最高,须根次之,根中表达量最低。结论PjSE基因的克隆、生信分析及原核表达研究,不仅有助于丰富竹节参中该类功能蛋白的种类和数量,完善竹节参皂苷类成分的生物合成途径,也为后期开展竹节参皂苷的异源合成提供了可供选择的关键基因元件。 展开更多

关键词 竹节参 鲨烯环氧酶 基因克隆 生物信息学分析 原核表达

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人参与三七鲨烯环氧酶家族的适应性进化 被引量：2

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作者 张朵朵 林丽梅 +2 位作者 国红玉 龙月红 邢朝斌 《华北理工大学学报（自然科学版）》 CAS 2022年第1期98-106,共9页

基于人参、三七基因组测序数据,在基因组水平上对SE基因家族进行鉴定,对其系统进化关系、基因结构、顺式作用元件以及SE基因复制事件等进行分析。结果表明,人参、三七的基因组中共鉴定到20个SE基因,聚为5个分支。SE基因在人参和三七中... 基于人参、三七基因组测序数据,在基因组水平上对SE基因家族进行鉴定,对其系统进化关系、基因结构、顺式作用元件以及SE基因复制事件等进行分析。结果表明,人参、三七的基因组中共鉴定到20个SE基因,聚为5个分支。SE基因在人参和三七中高度保守,所有SE均包含SE域和FAD/NAD(P)结合域。人参、三七的SE均含有干旱诱导元件、低温响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件等参与对植物激素和非生物胁迫响应的关键顺式调控元件。适应性进化分析结果显示,人参和三七SE基因在自然选择中是以纯化选择为主,人参和三七SE基因在进化过程中高度保守。 展开更多

关键词 鲨烯环氧酶 基因家族 适应性进化 人参 三七

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竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆与生物信息学分析 被引量：2

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作者 梁娥 齐敏杰 张来 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期788-794,共7页

根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因。结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE。生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99%... 根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因。结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE。生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99%、98%和98%。推测PjSE基因定位于线粒体(mTP)、叶绿体(cTP)和分泌途径(SP)。PjSE基因存在保守结构域FAD结合位点,含4个跨膜结构域和7个motif结构位点。PjSE蛋白二级结构以无规则卷曲(Random coli)和琢-螺旋(Alpha helix)为主要结构元件,延伸链(Extended strand)和茁转角(Beta turn)分散于整个蛋白质中,百分比依次占40.82%、37.48%、15.77%、5.94%;该蛋白能折叠形成典型的三维结构。 展开更多

关键词 竹节参 鲨烯环氧酶基因 克隆 生物信息学

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茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析 被引量：1

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作者 刘晓柳 谢珍妮 +3 位作者 钟灿 谢景 张水寒 金剑 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期144-152,共9页

目的:从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶(SE),并对其进行生物信息学及表达分析。方法:采用试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板,进行SE基因的克隆,对该基因进行生物信息学分析。通... 目的:从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶(SE),并对其进行生物信息学及表达分析。方法:采用试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板,进行SE基因的克隆,对该基因进行生物信息学分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检查茯苓鲨烯环氧酶基因(PcSE)在茯苓神舟10号、湘靖28、5.78菌株中的表达。结果:PcSE的基因全长为1 571 bp,包含4个外显子,3个内含子。获得编码区域(CDS)序列长为1 413 bp,编码470个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,有2个跨膜结构域,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,定位于线粒体或质膜上。与多孔菌科真菌的同源序列比对一致性为80.92%;系统进化树显示PcSE蛋白与美国茯苓的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示,PcSE基因在3个菌株中均有表达,在5.78菌株中的表达量最高,3个菌株的PcSE表达差异不存在统计学意义。结论:首次从茯苓中克隆并分析茯苓PcSE基因,为进一步研究茯苓PcSE的功能及解析茯苓三萜生物合成途径提供了基础。 展开更多

关键词 茯苓 鲨烯环氧酶(SE)基因 基因克隆 生物信息学分析 基因表达

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