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马缨杜鹃查尔酮异构酶(RdCHI1)重组蛋白的制备及功能验证
1
作者 王聿晗 孙世宇 +2 位作者 鞠志刚 孙威 徐小蓉 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期574-582,共9页
【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔... 【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔酮异构酶RdCHI1基因的序列信息设计引物,构建其原核表达载体,优化RdCHI1可溶性重组蛋白最佳诱导表达条件,制备可溶性重组蛋白并检测其活性。【结果】成功构建RdCHI1原核表达载体,RdCHI1重组蛋白可在上清中表达,最佳诱导条件为:15℃、36 h,IPTG浓度0.35 mmol·L^(-1)。经镍柱纯化得到质量较好的RdCHI1重组蛋白,通过体外酶活反应确定,与对照组相比,RdCHI1可以更快地催化柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)反应生成柚皮素(Naringenin)。【结论】RdCHI1为I型CHI,可极大提高柚皮素查尔酮生成柚皮素的速率,增加黄酮类物质积累量。 展开更多
关键词 马缨杜鹃 查尔酮异构酶 原核表达载体 可溶性重组蛋白 酶活测定
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丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffin-α的基因克隆、表达及抗肿瘤活性研究
2
作者 楼秋雯 陈为为 +2 位作者 黄志广 安紫珲 朱振洪 《浙江中医药大学学报》 CAS 2020年第8期707-714,共8页
[目的]克隆丝瓜籽Luffin-α基因,优化其在大肠杆菌中可溶性表达的条件,并进行初步的抗肿瘤活性测定。[方法]采用反转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法克隆获得丝瓜籽Luffin-α基因,构建pGEX6P-1/Lu... [目的]克隆丝瓜籽Luffin-α基因,优化其在大肠杆菌中可溶性表达的条件,并进行初步的抗肿瘤活性测定。[方法]采用反转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法克隆获得丝瓜籽Luffin-α基因,构建pGEX6P-1/Luffin-α表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株,摸索不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度对重组蛋白可溶性表达的影响。以谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析方法纯化目标蛋白,并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot对其进行检测及鉴定。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(methylazo salt trace enzyme reaction colorimetric assey,MTT)探讨其抗肿瘤活性。[结果]成功克隆丝瓜籽Luffin-α基因,全长834bp。优化后的可溶性蛋白表达条件为16℃,0.8mmol·L^-1的IPTG诱导20h。SDS-PAGE和Western blot分析鉴定可见相对分子质量约为56kDa的特异性条带。经MTT法检测,重组蛋白对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231均有显著的抑制效果。[结论]成功建立Luffin-α大肠杆菌表达系统,并优化表达条件,初步鉴定重组蛋白具有较好的抗肿瘤活性,为后续相关药物的开发奠定基础。 展开更多
关键词 Luffin-α基因 丝瓜 克隆 IPTG浓度 诱导温度 可溶性表达 重组蛋白 抗肿瘤活性
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人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达
3
作者 缪士涛 胡敏 宫兴文 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第12期187-193,共7页
通过将乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2... 通过将乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b(+)上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b(+)-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca^(2+)、K^(+)、Na^(+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)都对酶有激活作用,且Mg^(2+)效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。 展开更多
关键词 乙醛脱氢酶2 包涵体 融合表达 NusA-tag 重组蛋白
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利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体 被引量：2
4
作者 吴小霞 卢英华 +2 位作者 李清彪 邓旭 徐志南 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期380-384,共5页
用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第14 1个到第2 81个氨基酸的cDNA ,将其与hCG_β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3_H3。为提高shFasL的... 用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第14 1个到第2 81个氨基酸的cDNA ,将其与hCG_β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3_H3。为提高shFasL的表达量,对质粒pMB12neo作了改造,得到衍生质粒pMB74。利用质粒pMB74克隆表达shFasL ,得到高通量表达shFasL的重组菌AX3_pLu8。在复杂培养基HL_5C中,重组菌的细胞密度可达(1 5～2 )×10 7 mL ,AX3_H3及AX3_pLu8分泌的shFasL浓度分别为2 3 5 μg L及2 0 6 μg L。利用合成培养基SIH培养重组菌AX3_H3及AX3_pLu8,细胞密度均达到(4～5 )×10 7 mL ,shFasL浓度则分别达到111μg L和4 2 0 μg L。 展开更多
关键词 可溶性人Fas配体 盘基网柄菌 重组蛋白 培养
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人sIL-4R基因克隆及表达的研究
5
作者 田光 王希良 +4 位作者 孔祥英 姚碧涛 王英 武素琴 赵光宇 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第S1期11-13,17,共4页
目的 获得人sIL-4R重组蛋白的表达。方法 利用RT-PCR从Rail细胞分离出人sIL-4R基因,将编码的sIL-4RcDNA片段克隆到pMD18-T载体中进行DNA测序,进一步酶切sIL-4R DNA片段克隆于pQE80L表达载体,筛选鉴定pQE80L/sIL-4R重组质粒后转化大肠杆... 目的 获得人sIL-4R重组蛋白的表达。方法 利用RT-PCR从Rail细胞分离出人sIL-4R基因,将编码的sIL-4RcDNA片段克隆到pMD18-T载体中进行DNA测序,进一步酶切sIL-4R DNA片段克隆于pQE80L表达载体,筛选鉴定pQE80L/sIL-4R重组质粒后转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE、Western blotting检测sIL-4R基因的表达。结果 扩增获得621bp特异的sIL-4R DNA目的片段,并在大肠杆菌中获得人sIL-4R重组蛋白的表达。结论 为人sIL-4R的临床应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人可溶性白介素4受体 克隆表达 重组蛋白
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