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超分辨显微技术结合smFISH方法在E.coli sRNA SgrS定位中的应用
1
作者 王净 阮崇美 +2 位作者 白园园 韩延平 杨瑞馥 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第4期415-422,共8页
细菌调节小RNA通常与靶mRNA结合,影响翻译和mRNA降解过程.了解细菌小RNA的定量和定位信息,将有助于揭示细菌转录后水平的调控机制.小RNA SgrS通过抑制ptsG mRNA翻译起始,参与细菌磷酸葡萄糖代谢的应激过程.本研究应用单分子荧光原位杂交... 细菌调节小RNA通常与靶mRNA结合,影响翻译和mRNA降解过程.了解细菌小RNA的定量和定位信息,将有助于揭示细菌转录后水平的调控机制.小RNA SgrS通过抑制ptsG mRNA翻译起始,参与细菌磷酸葡萄糖代谢的应激过程.本研究应用单分子荧光原位杂交(smFISH)方法和超分辨显微技术可视化定位大肠杆菌细胞内小RNA SgrS,并初步验证伴侣分子Hfq蛋白和RNaseE降解酶对小RNA SgrS定位的影响.选取大肠杆菌模式菌MG1655 (野生株)、sgrS敲除株(△sgrS)和过表达株(△sgrS-pBAD-SgrS),使用RNA印迹和smFISH方法验证SgrS的过表达.应用smFISH方法分别在野生菌株、hfq敲除株(△hfq)和rne敲除株(△rne-710)中定位小RNA SgrS和ptsG mRNA,超分辨成像观察.与野生株相比,△hfq和△rne-710中SgrS主要定位于近膜区域,ptsG mRNA定位于细菌胞浆中,并且这两种RNA拷贝数均极显著增加.以上结果表明,分别敲除大肠杆菌hfq和rne-710基因导致SgrS和ptsG mRNA的表达量增加. smFISH方法和超分辨技术的结合应用为细菌RNA的直观定量和定位提供了高敏感性的检测方法,可用于基因调控的功能研究. 展开更多
关键词 大肠杆菌 Northern BLOT smfish 超分辨显微技术 SRNA SgrS HFQ RNASE E ptsG mRNA
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大肠杆菌小RNASgrS单分子原位成像方法的建立
2
作者 王净 韩延平 杨瑞馥 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第24期2804-2813,共10页
为了确定单分子Sgr S的空间定位,在野生株Escherichia coli MG1655基础上,构建敲除株(35)sgr S和过表达株(35)sgr S-p BAD-Sgr S,并以3株菌为供试菌株建立了定位大肠杆菌Sgr S的单分子荧光原位杂交(sm FISH)方法.优化条件为:杂交后细菌... 为了确定单分子Sgr S的空间定位,在野生株Escherichia coli MG1655基础上,构建敲除株(35)sgr S和过表达株(35)sgr S-p BAD-Sgr S,并以3株菌为供试菌株建立了定位大肠杆菌Sgr S的单分子荧光原位杂交(sm FISH)方法.优化条件为:杂交后细菌洗涤次数为5次,涂片时加入Slow Fade Diamond Antifade Mountant防淬灭,细菌在杂交液和探针的混合液中经40℃杂交3 h,杂交前探针置98℃变性10 min,Alexa-555 WGA染料用来标记细胞壁.sm FISH操作步骤确定为:固定-洗涤-透化-预杂交-杂交-洗涤-染细胞壁-洗涤-涂片,最后使用N-SIM超分辨率显微镜观察成像.定位结果显示,Sgr S呈绿色点状荧光弥散分布于细菌胞浆中,Alexa-555 WGA染料标记细胞壁呈红色,从而完整地定位了大肠杆菌的形态.sm FISH方法和超分辨显微技术的结合可为深入研究细菌模式基因s RNA的定位以及s RNA介导的调控机制提供线索和技术支持. 展开更多
关键词 大肠杆菌 SRNA SgrS 单分子荧光原位杂交 超分辨率显微镜 Alexa-555 WGA
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