多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157 被引量：12

1

作者 梅明珠 严亚贤 +3 位作者 陆承平 刘佩红 王建 沈莉萍 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期351-354,共4页

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度... 目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157 PCR rfbe vt1 vt2 EAE

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E.coli O157:H7 LAMP检测方法的建立 被引量：7

2

作者 朱海 吕敬章 +4 位作者 范放 洪小柳 马淑棉 黄李华 刘慧玲 《分子诊断与治疗杂志》 2010年第2期98-101,共4页

目的建立检测E.coli O157:H7环介导的等温扩增方法(LAMP)。方法选取E.coli O157:H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157:H7 LAMP体系具有良好的特... 目的建立检测E.coli O157:H7环介导的等温扩增方法(LAMP)。方法选取E.coli O157:H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157:H7 LAMP体系具有良好的特异性,用该体系对9属13种41株菌进行检测,结果只有E.coli O157:H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带,非E.coli O157:H7均未产生扩增产物,灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测,E.coli O157:H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%,2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157:H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题,而且检测方法简便、快捷,非常便于基层实验室和现场检测使用。 展开更多

关键词 环介导的等温扩增 E.coliO157:H7 rfbe

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肠出血性大肠杆菌O157：H7 rfbE与fliC基因的表达及鉴定 被引量：7

3

作者 潘群兴 王永山 +3 位作者 刘洁 夏兴霞 何孔旺 张雪寒 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期568-571,共4页

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157∶H7的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在E.coliBL21(DE3)中表达。结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在E.coliBL21(D... 利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157∶H7的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在E.coliBL21(DE3)中表达。结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在E.coliBL21(DE3)中表达的rfbE、fliC具有良好的免疫活性。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌 rfbe FLIC 免疫活性

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城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE的实时荧光定量PCR检测 被引量：6

4

作者 谢润欣 张崇淼 +2 位作者 王晓昌 孙婷婷 李宪 《环境科学研究》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第8期922-926,共5页

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性.将重组质粒作为模板,分别测定... 针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性.将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105copy,rfbE基因模板量4.98～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系〔R2为0.997(eaeA)和1.000(rfbE)〕.结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL.利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显. 展开更多

关键词 病原性大肠埃希氏菌 eaeA rfbe 实时荧光定量PCR 城市污水

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基于RAA技术快速检测EHEC-O157型核酸方法的建立

5

作者 任宝红 郭瑞 +2 位作者 韩小改 段蕾 贾继民 《食品工程》 2024年第2期72-75,共4页

针对肠出血性大肠埃希氏菌O157型建立一种核酸诊断方法。针对该病原的rfbE基因,利用重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided isothermal amplification,RAA)技术建立检测方法,并做性能评价。该方法在20 min内完成扩增,与多种标准菌... 针对肠出血性大肠埃希氏菌O157型建立一种核酸诊断方法。针对该病原的rfbE基因,利用重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided isothermal amplification,RAA)技术建立检测方法,并做性能评价。该方法在20 min内完成扩增,与多种标准菌株无交叉反应,质粒10 copies/μL或菌液102 CFU/mL可以检出阳性,37℃加压48 h后数据稳定。该方法在特异性、敏感性、稳定性表现良好,可用于肠出血性大肠埃希氏菌O157型检测。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增 O157 rfbe

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EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用 被引量：7

6

作者 李丽 张雪寒 +13 位作者 何孔旺 姜平 赵攀登 叶青 栾晓婷 温立斌 倪艳秀 周俊明 吕立新 郭容利 俞正玉 茅爱华 李彬 王小敏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期59-66,共8页

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以E... 建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。 展开更多

关键词 O157:H7 二重PCR 方法建立 细菌分离 样品检测

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肠出血性大肠杆菌(O157:H7)的特异性荧光探针检测方法的建立 被引量：4

7

作者 姜君 王鹏志 +2 位作者 刘利成 吴伟立 陈唯军 《现代生物医学进展》 CAS 2012年第12期2201-2204,共4页

目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5'端用FAM基团标记,3'端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优... 目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5'端用FAM基团标记,3'端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优化了大肠杆菌0157:H7的荧光定量PCR检测方法。结果:在人工污染样本无需富集的情况下,检测的最低DNA浓度是10拷贝/反应(3CFU/mL);特异性检测实验中,0157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非0157:H7菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批内、批间变异系数均小于3%。结论:实验结果显示此荧光定量PCR方法特异性、灵敏度高,重复性好,可对分离的可疑大肠杆菌0157:H7菌株进行快速鉴定。 展开更多

关键词 大肠杆菌0157:H7 荧光定量PCR(real-timePCR) TAQMAN探针 rfbe

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MGB(Minor Groove Binder)复合探针二重实时定量PCR检测大肠杆菌O157

8

作者 朱向玲 严亚贤 +3 位作者 陆承平 刘佩红 王建 沈莉萍 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期897-900,共4页

以大肠杆菌O157rfbE和stx2为待检靶基因,设计两对引物和两条MGB探针,rfbE和stx2探针5′端分别用FAM和VIC基团标记,3′端均用Taqman-MGB标记。建立并优化了检测大肠杆菌O157的二重荧光定量PCR方法,可检测的最低DNA浓度是10拷贝/μL;实验... 以大肠杆菌O157rfbE和stx2为待检靶基因,设计两对引物和两条MGB探针,rfbE和stx2探针5′端分别用FAM和VIC基团标记,3′端均用Taqman-MGB标记。建立并优化了检测大肠杆菌O157的二重荧光定量PCR方法,可检测的最低DNA浓度是10拷贝/μL;实验中O157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非O157菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批间差异小于80%,批内差异小于70%。实验结果显示此二重荧光定量PCR方法可对分离的可疑大肠杆菌O157菌株进行快速鉴定,同时得知菌株是否携带stx2毒力基因,有利于菌株毒力强弱的判定。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157 荧光定量PCR MGB探针 rfbe stx2

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大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测 被引量：28

9

作者 胡慧 陈雅君 +5 位作者 段志刚 孟振北 彭新然 张龙现 崔保安 王亚宾 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第12期278-282,共5页

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重... 为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157:H7 rfbe基因 SYBR GreenⅠ 实时PCR

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多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究 被引量：13

10

作者 朱文冠 薛素强 +2 位作者 洪洁心 崔剑峰 郭霄峰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期428-432,共5页

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的... 目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbEf、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157 H7 PCR rfbe基因 fliC基因 eaeA基因 SLT-Ⅰ基因 SLT-Ⅱ基因

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PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 被引量：12

11

作者 金慧英 陶开华 +4 位作者 李越希 陈华标 李法卿 李素芹 谭维国 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期394-395,共2页

目的　研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7的多重PCR方法 ,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响。方法　选择O15 7∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的 4对引物 ,分别或共同进行PCR扩增 ,检测 4 ... 目的　研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7的多重PCR方法 ,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响。方法　选择O15 7∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的 4对引物 ,分别或共同进行PCR扩增 ,检测 4 0株O15 7∶H7和非O15 7∶H7菌株 ,将细菌按 10 1～ 10 6稀释后比较PCR的检测灵敏度。结果　所有O15 7∶H7菌株均在 4 97bp和 6 2 5bp处出现O15 7抗原基因和H7抗原基因产物 ,其产毒株在4 84bp和 (或 ) 2 10bp处出现SLT2和 (或 )SLT1基因产物 ,非O15 7∶H7菌株PCR结果均为阴性 ;单一PCR检测灵敏度为 15 0CFU/PCR反应 ,多重PCR为 >15 0 0CFU/PCR反应。结论　在经过增菌后 ,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便 ,为产毒和非产毒O15 7∶H7的诊断提供了新的手段。 展开更多

关键词 PCR 肠出血 大肠杆菌O157:H7 聚合酶链反应 rfbe基因 fliC基因 毒素基因

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使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究 被引量：11

12

作者 易海华 赵金伟 +5 位作者 徐波 吴萍兰 宋阳威 房超 徐政 徐继承 《中国食品卫生杂志》 北大核心 2010年第3期206-213,共8页

目的探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测方法。方法针对编码O157∶H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isoth... 目的探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测方法。方法针对编码O157∶H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157∶H7和非O157∶H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较。同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的实际运用价值进行评估。结果LAMP法可以在1h内完成检测工作。LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%。结论LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高。LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157∶H7样本。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 环介导等温扩增 rfbe基因 fliC基因

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应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 被引量：11

13

作者 徐义刚 李丹丹 +2 位作者 崔丽春 刘忠梅 李苏龙 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第8期160-164,共5页

利用双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因设计一对DPO引物,经... 利用双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法,其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbe基因 双启动寡核苷酸引物聚合酶链式反应

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动物性食品中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立 被引量：8

14

作者 杨小鹃 吴清平 +1 位作者 张菊梅 张淑红 《中国卫生检验杂志》 CAS 2007年第11期1951-1953,2068,共4页

目的:大肠杆菌O157:H7是近年来引发食物中毒事件的重要病原菌,对其建立灵敏、特异的多重PCR检测方法,是确保饮食安全,预防和控制大肠杆菌O157:H7传播的重要手段。方法:根据大肠杆菌O157:H7rfbE和fliC抗原基因的保守序列设计了2对引物,... 目的:大肠杆菌O157:H7是近年来引发食物中毒事件的重要病原菌,对其建立灵敏、特异的多重PCR检测方法,是确保饮食安全,预防和控制大肠杆菌O157:H7传播的重要手段。方法:根据大肠杆菌O157:H7rfbE和fliC抗原基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为678 bp(rfbE)和560 bp(fliC)。结果:建立的多重PCR方法可以快速特异地检测出猪肉、牛肉等动物性食品中的大肠杆菌O157:H7污染,人工污染猪肉检测限达到2.2×102cfu/ml。结论:选择两对特异引物的多重PCR方法可简便、快速、特异地实现对动物性食品中大肠杆菌O157:H7的检测。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157:H7 多重PCR rfbe基因 fliC基因

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多酶恒温核酸快速扩增法检测大肠杆菌O157∶H7 被引量：8

15

作者 王淑娟 范一灵 +6 位作者 冯震 蒋波 宋明辉 李琼琼 刘浩 秦峰 杨美成 《上海预防医学》 CAS 2022年第6期511-518,共8页

【目的】采用多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)荧光法,结合金属有机骨架免疫磁珠富集功能,开发大肠杆菌O157∶H7快速富集和检测方法。【方法】以rfbE基因为靶标,筛选引物、探针及优化反应体系,同时考察该方法的特异性、灵敏度和实际应用情况... 【目的】采用多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)荧光法,结合金属有机骨架免疫磁珠富集功能,开发大肠杆菌O157∶H7快速富集和检测方法。【方法】以rfbE基因为靶标,筛选引物、探针及优化反应体系,同时考察该方法的特异性、灵敏度和实际应用情况。【结果】检测大肠杆菌O157∶H7菌体的检测限为1.18×10^(5) CFU‧mL^(-1),菌体DNA质量浓度检测限为9 pg‧µL^(−1),检测过程可在20 min内完成。47株菌(24株目标菌和23株非目标菌)特异性验证结果与实时荧光定量聚合酶链式反应(RT⁃PCR)方法一致。【结论】该研究开发了一种基于金属有机骨架免疫磁珠富集结合MIRA的检测方法,该法操作简单、反应迅速,适用于食品中大肠杆菌O157∶H7的快速富集和检测。 展开更多

关键词 多酶恒温核酸快速扩增技术 金属有机骨架免疫磁珠 rfbe基因 大肠杆菌O157∶H7

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快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价 被引量：9

16

作者 张雪寒 何孔旺 +6 位作者 叶青 倪艳秀 温立斌 李彬 王小敏 周俊明 郭容利 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1027-1031,共5页

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验。结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果。在灵敏度... 利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验。结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果。在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1CFU/g。在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应。试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求。 展开更多

关键词 环介导恒温扩增技术 rfbe基因 快速检测

原文传递

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H 被引量：5

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作者 任宝红 付燕峰 +5 位作者 娄亚坤 苗银萍 曾小宇 杨楠 姬建生 郭瑞 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第2期264-270,共7页

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片... 目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。 展开更多

关键词 大肠埃希氏菌O157:H7 rfbe保守区域 实时荧光聚合酶链式反应技术 探针 快速扩增

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IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用 被引量：8

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作者 王琪 徐文娟 石盼盼 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第17期263-269,共7页

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE基因,应用等温多自配引发扩增技术(Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA)... 为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE基因,应用等温多自配引发扩增技术(Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA),设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×10^(2) CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论:IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。 展开更多

关键词 肠出血大肠杆菌 O157∶H7 等温多自配引发扩增技术(IMSA) rfbe基因 快速检测

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肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用 被引量：7

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作者 徐义刚 崔丽春 +4 位作者 李苏龙 于恒纯 李丹丹 谢晓峰 姜艳春 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期618-623,共6页

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设... 目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。 展开更多

关键词 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 rfbe基因 环介导恒温扩增 快速检测

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肠出血性大肠埃希菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 被引量：5

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作者 李丹丹 徐义刚 +2 位作者 王绥家 高慎阳 李一经 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第7期81-84,共4页

本试验针对肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7高度保守的rfbE基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测EHEC O157∶H7实时荧光定量PCR方法。结果显示,该法灵敏度约为7.3CFU/mL... 本试验针对肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7高度保守的rfbE基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测EHEC O157∶H7实时荧光定量PCR方法。结果显示,该法灵敏度约为7.3CFU/mL,对310份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出阳性样本20份,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。表明建立的实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。 展开更多

关键词 肠出血性大肠埃希菌0157 H7 rfbe基因 荧光定量PCR 快速检测

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