通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨 被引量：5

1

作者 周镇先 戴星 孟继鸿 《东南大学学报（医学版）》 CAS 2004年第3期141-144,共4页

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区... 目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。 展开更多

关键词 通用性引物 RT-nPCR扩增 基因型 戊型肝炎病毒 基因组 逆转录-巢式聚合酶链反应

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乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：12

2

作者 高正琴 贺争鸣 +2 位作者 邢瑞昌 卫礼 王吉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期279-282,共4页

目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT ... 目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。 展开更多

关键词 乙脑病毒 反转录-嵌套式聚合酶链反应 检测

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检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用 被引量：5

3

作者 司微 崔尚金 +1 位作者 张洪英 刘立奎 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期222-226,共5页

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT... 根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 复合反转录-套式聚合酶链式反应 鉴别诊断

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中国七个地区1998-2005年急性腹泻住院患儿中星状病毒感染研究 被引量：46

4

作者 方肇寅 孙亚萍 +6 位作者 叶新华 王慧 章青 段招军 Xi Jiang Duncan Steele Roger Glass 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期673-676,共4页

目的研究中国5岁以下腹泻住院患儿中星状病毒感染的流行病学特点,确定流行毒株血清型。方法选择国内7个地区收集5岁以下腹泻住院患儿粪便标本,应用酶联免疫或PCR方法检测星状病毒,对星状病毒阳性标本应用RT-PCR方法分型并经测序确证。结... 目的研究中国5岁以下腹泻住院患儿中星状病毒感染的流行病学特点,确定流行毒株血清型。方法选择国内7个地区收集5岁以下腹泻住院患儿粪便标本,应用酶联免疫或PCR方法检测星状病毒,对星状病毒阳性标本应用RT-PCR方法分型并经测序确证。结果1998-2005年在7个地区的凋查点共收集1668份急性腹泻粪便标本,检测出星状病毒阳性标本91份,平均检出率为5．5％;病例全年均有发生,发病高峰主要集中在10月份到次年1月份;95％患儿年龄在2岁以下,其中以9-11月龄儿童发病最多,检出率为7.4％,12-17月龄、6-8月龄、0-6月龄儿童的检出率依次为6．1％、5.6％、5．6％。确定型别的49份标本中45份为HAstV-1型,1例为HAstV-3型,2例为HAstV-5型,1例为HAstV-8型。结论星状病毒是中国婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,流行毒株以1型为主,同时存在多个型别的散在流行。 展开更多

关键词 星状病毒 巢式逆转录聚合酶链反应 流行病学

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鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立 被引量：26

5

作者 李艳 仇华吉 +5 位作者 王秀荣 张守发 朱庆虎 李娜 李国新 童光志 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期1907-1914,共8页

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨... 【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 反转录-复合套式聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性分析

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新疆猪粪便戊型肝炎病毒RNA的检测及序列分析 被引量：16

6

作者 马勋 陆承平 《中国病毒学》 CSCD 2004年第4期360-363,共4页

从戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEVRNA,其中13份为阳性,阳性率18.57%。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建成重组质粒并测序,结果表明,13株... 从戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEVRNA,其中13份为阳性,阳性率18.57%。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建成重组质粒并测序,结果表明,13株猪源HEV分离株在HEVORF2348bp核苷酸序列的同源性为97.1%～100%,为同一基因型;与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的同源性分别为74.1%～77.6%,71.6%～74.1%,73.3%～78.2%和82.8%～91.4%,与ⅣA亚型的同源性同源性最高达89.4%～91.4%。以该核苷酸片段绘制的基因进化树显示13株猪源HEV与HEVⅣT1株在同一分支上,属基因Ⅳ型;与国内其他猪源HEV分离株该片段核苷酸序列的同源性为82.6%～91.3%,提示中国猪源HEV的基因型比较一致,同属HEVⅣ型。 展开更多

关键词 戊型肝炎病毒 RNA 序列分析 基因型 猪 粪便

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新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立 被引量：6

7

作者 李安 崔言顺 +5 位作者 沈志强 谢金文 王金良 曲光刚 李峰 李建亮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期21-25,共5页

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒... 对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 反转录-复合套式聚合酶链式反应 强毒 兔化弱毒疫苗

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庚型肝炎病毒感染的临床特点及对外周血单个核细胞感染的研究 被引量：2

8

作者 柴宁莉 张树林 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期91-93,共3页

目的　探讨庚型肝炎病毒 (HGV)感染的临床特点及其在体内的亲嗜性和复制位点。方法　采用逆转录 套式聚合酶链反应 (RT nestedPCR)对 12 9例高危人群的血清及其中 5 9例的外周血单个核细胞 (PBMCs)进行HGVRNA正、负链检测、临床分析。... 目的　探讨庚型肝炎病毒 (HGV)感染的临床特点及其在体内的亲嗜性和复制位点。方法　采用逆转录 套式聚合酶链反应 (RT nestedPCR)对 12 9例高危人群的血清及其中 5 9例的外周血单个核细胞 (PBMCs)进行HGVRNA正、负链检测、临床分析。结果　 9例单纯HGV感染者中 ,急性肝炎 3例 ,慢性肝炎 3例 ,另 3例为无症状携带者 ;HGV对PBMCs的感染率 (35 .7% )显著低于丙型肝炎病毒 (HCV)感染 (77.3% ,P <0 .0 5 ) ;全部标本中均未发现HGVRNA负链存在。结论　HGV感染可引起急、慢性肝炎 ,但临床症状轻 ;HGV可感染PBMCs ,但较HCV感染能力弱 ; 展开更多

关键词 庚型肝炎病毒 病毒核酸正链 病毒核酸负链 外周血单个核细胞 逆转录套式聚合酶链反应 HGV

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我国不同人群及各型肝炎病人庚型肝炎感染检测分析 被引量：11

9

作者 凌斌华 庄辉 +2 位作者 李盛 杨乐薇 崔怡辉 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 1998年第3期145-146,共2页

应用酶联免疫试验（ＥＩＡ）检测抗ＨＧＶ、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、抗ＨＢｃ和抗ＨＣＶ，对抗ＨＧＶ阳性的部分标本进一步用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴｎＰＣＲ）检测ＨＧＶＲＮＡ。结果各类人群及肝炎病人抗ＨＧＶ... 应用酶联免疫试验（ＥＩＡ）检测抗ＨＧＶ、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、抗ＨＢｃ和抗ＨＣＶ，对抗ＨＧＶ阳性的部分标本进一步用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴｎＰＣＲ）检测ＨＧＶＲＮＡ。结果各类人群及肝炎病人抗ＨＧＶ阳性率分别是：一般人群１０％（４／３９５），献全血员３６％（１０／２７８），某单采浆点人群１２９％（７０／５４１），静脉毒瘾者１３５％（２２／１６２），血透析病人２１４％（１２／５６），ＨＢｓＡｇ携带者１２０％（３／２５），慢性乙型肝炎病人２６２％（１１／４０），慢性丙型肝炎病人１２５％（１７／１３６），肝硬化病人３６４％（４／１１），慢性非甲戊型肝炎病人１８８％（３／１６）。提示献血员、静脉毒瘾者、血透析病人及ＨＢＶ或ＨＣＶ感染者是ＨＧＶ感染的高危人群；ＨＧＶ常与ＨＢＶ或ＨＣＶ重叠／联合感染，也可单独感染；ＨＧＶ是非甲戊型肝炎的致病因子之一。抗ＨＧＶ阳性者中ＨＧＶＲＮＡ检出率为６６％（６４／９７），提示抗ＨＧＶＥＩＡ可用于ＨＧＶ感染的检测。 展开更多

关键词 庚型肝炎 乙型肝炎 丙型肝炎 酶联免疫试验 PCR

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逆转录多重套式聚合酶链反应在儿童病毒性脑炎病原学研究中的应用 被引量：5

10

作者 孙永梅 梁东 李海波 《小儿急救医学》 CAS 2005年第5期378-380,共3页

目的探讨早期同步检测病毒性脑炎(VE)主要病原新方法.方法应用逆转录多重套式聚合酶链反应(RT-M-nPCR)对100例VE患儿及73例对照组脑脊液(CSF)标本进行单纯疱疹病毒(HSV)DNA与肠道病毒(EV)RNA同步检测.结果整个过程约需5 h.该法与ELISA... 目的探讨早期同步检测病毒性脑炎(VE)主要病原新方法.方法应用逆转录多重套式聚合酶链反应(RT-M-nPCR)对100例VE患儿及73例对照组脑脊液(CSF)标本进行单纯疱疹病毒(HSV)DNA与肠道病毒(EV)RNA同步检测.结果整个过程约需5 h.该法与ELISA及经典nPCR方法比较,符合率分别为96%及100%.100例VE患儿CSF标本中,HSV阳性18例,EV阳性17例,在100例VE中,有26例重症,其中HSV感染14例(53.85%),EV感染7例(26.92%),不明病原5例(19.23%).不同病原检出率与年龄的关系:年龄～3岁、～7岁、～14岁HSV分别检出7.4%、11.9%、35.5%,EV分别检出25.9%、19.05%、6.5%.结论RT-M-nPCR是一种能在早期同步检测HSV及EV的具有巨大潜在应用价值的病原检测技术;在VE重症中HSV感染最常见;HSV感染在年长儿发病率高,而EV感染在学龄前及婴幼儿中多见. 展开更多

关键词 病毒性脑炎 逆转录多重套式聚合酶链反应 单纯疱疹病毒 肠道病毒

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应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文) 被引量：6

11

作者 张寿斌 廖华 +3 位作者 黄呈辉 谭庆瑜 张炜灵 陈侃 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2004年第22期33-37,共5页

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及16... 目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。 展开更多

关键词 逆转录聚合酶链反应 肠道病毒 通用引物

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安徽省不同人群及各型肝炎患者庚型肝炎病毒感染检测分析

12

作者 宋海波 董辉军 《微生物学免疫学进展》 1999年第4期42-44,共3页

应用酶联免疫试验（ＥＩＡ）和逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）对１００ 例一般人群、３８５例献血员、５４ 例血液透析患者、７２ 例乙型肝炎、４１ 例丙型肝炎２７ 例非甲－戊型肝炎患者进行检测。结果抗－ＨＧＶ 阳性率分... 应用酶联免疫试验（ＥＩＡ）和逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）对１００ 例一般人群、３８５例献血员、５４ 例血液透析患者、７２ 例乙型肝炎、４１ 例丙型肝炎２７ 例非甲－戊型肝炎患者进行检测。结果抗－ＨＧＶ 阳性率分别为２．００％ 、７．５３％ 、２７．７８％ 、１８．０６％ 、１９．５１％ 和１４．８１％ ；抗－ＨＧＶ 阳性者中ＨＧＶＲＮＡ 阳性率分别为１００．００％ 、６２．０７％ 、６６．６７％ 、６９．２３％ 、７５．００％ 和 １００．００％ ，提示本地区不同人群存在ＨＧＶ 感染。献血员、血透患者、乙型肝炎、丙型肝炎、非甲－戊型肝炎患者的ＨＧＶ 感染率显著高于一般人群，提示献血员，血透患者及ＨＢＶ、ＨＣＶ 感染者是ＨＧＶ 感染的高危人群。ＨＧＶ 常与ＨＢＶ 或ＨＣＶ 重叠／联合感染，也可单独感染。抗－ＨＧＶ 阳性者中ＨＧＶ ＲＮＡ 阳性率为８３．８２％ ，提示抗－ＨＧＶＥＩＡ 可用于ＨＧＶ 感染的检测。ＡＬＴ 正常和异常献血员中抗－ＨＧＶ 阳性率无显著性差异。 展开更多

关键词 庚型肝炎病毒 逆转录套式 聚合酶链反应 ELISA

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原发性肝癌患者庚型肝炎病毒感染的临床研究 被引量：1

13

作者 魏群 张弘 +3 位作者 黄介飞 江枫 倪润洲 肖明兵 《南通医学院学报》 2001年第2期134-134,共1页

目的 :探讨原发性肝癌患者庚型肝炎病毒 (HGV)感染的状态。方法 :根据中国株 HGV 5 '端非编码序列设计引物 ,采用逆转录套式聚合酶链反应方法。用此技术对 10 7例原发性肝癌、45例慢性肝炎、43例肝硬化患者血清进行了检测分析。结果... 目的 :探讨原发性肝癌患者庚型肝炎病毒 (HGV)感染的状态。方法 :根据中国株 HGV 5 '端非编码序列设计引物 ,采用逆转录套式聚合酶链反应方法。用此技术对 10 7例原发性肝癌、45例慢性肝炎、43例肝硬化患者血清进行了检测分析。结果 :10 7例原发性肝癌患者中有 10例 HGV- RNA阳性 (9.3% ) ;45例慢性肝炎患者中有 5例HGV- RNA阳性 (11.1% ) ;43例肝硬化患者中有 3例 HGV- RNA阳性 (7.0 % )。结论 :庚型肝炎病毒感染可能与原发性肝癌发生有一定关系 。 展开更多

关键词 庚型肝炎病毒 原发性肝癌 逆转录套式聚合酶链反应

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