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题名人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析
被引量：1
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作者
刘姗
刘美丽
刘丹
闫承慧
田孝祥
刘艳霞
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机构
北部战区总医院心内科/全军心血管病研究所实验室/全军心血管急重症救治重点实验室/辽宁省心血管病转化医学研究重点实验室
国家老年疾病临床研究中心北部战区总医院老年医学中心干二科
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出处
《解放军医学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第7期585-592,共8页
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基金
辽宁省自然科学基金指导计划项目(20170540965,20170540929,20180550368)
中国博士后科学基金面上项目(2018M633697)~~
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文摘
目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78) bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区。采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子。结果通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体。荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP_1hCREG_586转录活性最高(P<0.05),pEGFP1_hCREG_358转录活性最低(P<0.05),pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_478转录活性差异均无统计学意义(P>0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5’上游序列–508/–281 bp区域。生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1。结论成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子。
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关键词
E1A激活基因阻遏子
转录启动子
报告基因质粒
绿色荧光蛋白质类
聚合酶链反应
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Keywords
cellular repressor of E1A-stimulated genes
transcription initiation site
reporter genes plasmid
green fluorescent proteins
polymerase chain reaction
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分类号
R331
[医药卫生—人体生理学]
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