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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建 被引量:12
1
作者 刘思国 康丽娟 +4 位作者 江国托 孔宪刚 卢中冶 刘忠贵 卢景良 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期14-16,共3页
将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N... 将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N。对重组质粒进行大量扩增 ,应用聚乙二醇纯化后 ,对 SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验 ,结果表明 ,IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 核蛋白基因 重组真核表达质粒 基因免疫 载体构建
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戊型肝炎病毒Ⅳ型的ORF3及ORF2蛋白的分片段表达、纯化及抗原性分析 被引量:14
2
作者 王佑春 张华远 +8 位作者 辜文洁 李卓 李振勇 王云龙 郝娃 蓝海云 林京香 TimJ Harrison 李河民 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期257-261,共5页
目的 对戊型肝炎病毒 (HEV)Ⅳ型ORF3的全长基因片段和 4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达 ,对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法 将O3、FB5、E4、F2 2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis,用IPTG进行诱... 目的 对戊型肝炎病毒 (HEV)Ⅳ型ORF3的全长基因片段和 4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达 ,对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法 将O3、FB5、E4、F2 2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis,用IPTG进行诱导表达 ,并用反向、分子筛、离子交换和亲和层析方法进行纯化 ,用纯化的蛋白分别制备检测抗HEVIgG的诊断试剂 ,用该试剂检测急性散发性的戊肝病人和非戊肝病人血清。结果 位于ORF2N 端的FB5蛋白在急性期的戊肝病人血清中具有最强的反应性 ;而且仍有部分被HEVⅠ型或 /和Ⅱ型的诊断试剂排除的急性非戊肝病人血清对HEVⅣ型的多肽呈阳性反应。结论 为早期诊断戊肝病毒的感染 ,其诊断试剂应含有HEVⅣ型的ORF2N 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒Ⅳ型 戊型肝炎病毒 基因重组 基因表达 质粒 ORF3蛋白 ORF2蛋白
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人生长激素的真核细胞表达质粒的构建及鉴定 被引量:8
3
作者 宋向凤 王辉 +1 位作者 邓保国 石太新 《新乡医学院学报》 CAS 2002年第2期84-86,共3页
目的 构建人生长激素的真核细胞表达质粒。方法 用双酶切从 pUC19-GHcDNA中克隆出生长激素基因 ,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3中 ,行酶切和测序以鉴定。结果 重组的真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA所含的GHcDNA序列和插入方... 目的 构建人生长激素的真核细胞表达质粒。方法 用双酶切从 pUC19-GHcDNA中克隆出生长激素基因 ,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3中 ,行酶切和测序以鉴定。结果 重组的真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA所含的GHcDNA序列和插入方向均正确。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒 展开更多
关键词 人生长激素 基因重组 真核表达质粒 基因治疗
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重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响 被引量:6
4
作者 陆奎英 崔素芬 +4 位作者 徐亮 张玲玲 丁永玲 覃文新 包广宇 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期898-901,共4页
目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,wester... 目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用(F分别为162.31,184.65,P均<0.01);抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义(P均>0.05);pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白(Mr约为38 000),ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。结论重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。 展开更多
关键词 重组DKK1 真核表达质粒 pCMV-HA2/DKK1 HELA细胞 细胞增殖
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东方山羊豆水通道蛋白基因的克隆及初步分析 被引量:6
5
作者 吴晓静 王学敏 +3 位作者 高洪文 Dzyubenko Nikolay Chapurin Vladimir 刘大林 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期331-339,共9页
根据已知EST片段结合RT-PCR和RACE技术,从东方山羊豆(Galega Orientalis)中克隆到一个水通道蛋白(AQP)基因,命名为GoAQP(GenBank登录号:HM 803185)。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1258bp,开放读码框(ORF)870 bp,编码289个氨基酸... 根据已知EST片段结合RT-PCR和RACE技术,从东方山羊豆(Galega Orientalis)中克隆到一个水通道蛋白(AQP)基因,命名为GoAQP(GenBank登录号:HM 803185)。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1258bp,开放读码框(ORF)870 bp,编码289个氨基酸。GoAQP包含MIP家族信号序列HINPAVT/SFG,高等植物PIP高度保守序列GGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。与拟南芥AQP基因家族的系统进化分析表明,GoAQP属于PIP1亚型AQP蛋白。Real-Time PCR检测结果表明,GoAQP基因在根中表达量最高,茎中表达量最少;且受NaCl和PEG胁迫表达上调,NaCl表达呈双峰分布。因此GoAQP基因可能参与了东方山羊豆耐盐性调控。同时成功构建超表达载体pCAMBIA-1302-GoAQP,为转基因验证基因功能创造了基础。 展开更多
关键词 东方山羊豆 水通道蛋白基因 表达分析 表达载体构建
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用DNA免疫研制鸡白细胞介素2单克隆抗体 被引量:4
6
作者 提金凤 张艳梅 +3 位作者 李志杰 宋宗好 郝贵杰 刘秀梵 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期537-540,共4页
构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原... 构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后共获得3株针对鸡IL-2的特异性单克隆抗体,并对这3株单克隆抗体的特性进行了鉴定。 展开更多
关键词 DNA免疫 鸡白细胞介素2 重组表达质粒
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罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建 被引量:4
7
作者 李庆勇 可小丽 +2 位作者 卢迈新 朱华平 高风英 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期92-99,共8页
为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基... 为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(catalytic triad)位点、7个假定活性位点(putative active site)、2个特异位点(spe-cific hits),以及4个超家族结构(2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53 superfamily、1个类纤连蛋白超家族结构DUF1034 superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily);并且该氨基酸序列有多个抗原表位,推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性,可作为候选的蛋白疫苗成分。将该片段插入原核表达载体pET32a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆,经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a(+)/scpB。 展开更多
关键词 罗非鱼 无乳链球菌 C5a肽酶 克隆 原核表达质粒
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猪干扰素-γ哺乳动物细胞重组表达质粒作为疫苗佐剂在小鼠体内的组织分布及环境安全性研究 被引量:3
8
作者 蒙学莲 景志忠 +5 位作者 房永祥 窦永喜 陈国华 贾怀杰 段凤云 才学鹏 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期289-294,共6页
重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌... 重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌肉途径免疫小鼠,免疫后不同时间迫杀,并取各种组织抽提基因组DNA:一是利用PCR技术检测其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性;二是以PCR技术检测免疫动物现场环境样品,监测pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒中的猪IFN-γ基因、CMV启动子基因和抗性基因是否转移和扩散到环境细菌中。结果表明,免疫24h后在小鼠的各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫5d后仅有1只小鼠注射部位肌肉和血液中存在重组表达质粒,免疫15d后所有动物的各组织中无重组表达质粒存在;同时未发现pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒对动物和环境是安全的。 展开更多
关键词 重组表达质粒 生物安全性 组织分布 基因组整合 转移和扩散
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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量:1
9
作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页
应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点... 应用PCR重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ⅢompA进行改建,除去原载体的HindⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子CAGGCC改为CAAGCT,从而引入一个新的HindⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源DNA编码序列,表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质,操作十分简便。 展开更多
关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应
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卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建 被引量:3
10
作者 刘凤娟 俞守义 +7 位作者 聂军 陈清 朱丽 芮勇宇 李建栋 江晓玲 吴敏 李志锋 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2004年第10期1193-1195,共3页
目的 克隆卡介苗 (BCG)D2株 32 -kDa分泌蛋白基因 (fbpA基因 ) ,构建重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA ,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础。 方法 采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因 ,构建重组克隆载体 pUCm -T -fbpA ,经过... 目的 克隆卡介苗 (BCG)D2株 32 -kDa分泌蛋白基因 (fbpA基因 ) ,构建重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA ,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础。 方法 采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因 ,构建重组克隆载体 pUCm -T -fbpA ,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单 /双酶切、DNA序列分析鉴定后 ,将fb pA基因亚克隆入植物表达载体 pBI 12 1,得到重组载体pBI 12 1-fbpA ,并转化根癌农杆菌株EHA10 5 ,用PCR法对其进行鉴定。结果 重组载体 pUCm -T -fbpA测序后证实fbpA基因由 10 4 1bp组成 ,包括 1个 10 14bp的开放阅读框。DNA序列上游由编码一段信号肽的 12 9bp组成 ,并对 32 -kDa蛋白的分泌起决定作用。相应的编码成熟蛋白的序列由 885个碱基组成。fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致。此外 ,构建的重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA10 5。结论 编码BCGD2株 32 -kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功 ,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守 ,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 卡介苗 32-kDa蛋白 tbpA 克隆 DNA序列分析 重组 植物表达载体
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A preliminary study on the cloning and expression of human papiilomavirus type 18 E6 gene in Escherichia coli
11
作者 文维延 徐钤 《Journal of Medical Colleges of PLA(China)》 CAS 1991年第1期15-20,共6页
We have cloned the E6 gene of human papillomavirus type 18 into anexpression plasmid pBD2.One of the recombinant plasmids (named pDV11) wasidentified by DNA analysis and protein product analysis.It could express a new... We have cloned the E6 gene of human papillomavirus type 18 into anexpression plasmid pBD2.One of the recombinant plasmids (named pDV11) wasidentified by DNA analysis and protein product analysis.It could express a newprotein whose molecular weight correspods well with the expected one.Afterpurification,the expressed protein showed a positive result in countercurrentimmuno-electrophoresis with anti-β-gal serum and was proved to be the expectedβ-gal/E6 fusion protein.The physical map of pDV11 was also prepared. 展开更多
关键词 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18 recombinant and expression LAC promoter expression plasmid fusion protein
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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建 被引量:2
12
作者 朱建中 卢春 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期453-454,共2页
目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中... 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 人疱疹病毒8型 K12基因 重组真核表达载体 构建
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Construction and Expression of Recombinant Ghrelin Plasmid and Effects on Growth Performance and Gastric Acid Secretion of Rats
13
作者 DU Gai-mei JIANG Jia-jin +6 位作者 YAN Wen-mei HU Zhi-hua LUO Bi-ping ZHANG Yu-hong ZHANG Miao LI Liu-an LIU Mao-jun 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2013年第5期227-231,共5页
The paper was to study construction and expression of rGhrelin (pcDNA3 -Ghrelin) and its effect on growth performance and gastric acid secretion of rats. Ghrelin amplified from gastric mucosa of weaned piglets was c... The paper was to study construction and expression of rGhrelin (pcDNA3 -Ghrelin) and its effect on growth performance and gastric acid secretion of rats. Ghrelin amplified from gastric mucosa of weaned piglets was cloned into the expression vector pcDNA3 to get recombinant plasmid pcDNA3 - Ghrelin. Twelve weaning rats were randomly divided into two groups, six rats each group. The rats in each treatment group were individually injected with 100pg of naked plasmid pcDNA3 -Ghrelin, and the rats in control group were injected with empty plasmid. The weights and feed consumption of rats were measured after injection for 7, 14 and 29 d, respectively. The rats were sacrificed at the end of the experiment, and their stomach was separated and weighed, the pH value of gastric juice was measured as well. The results showed that the average daily gain of rats at 7 and 29 d were significantly higher than that in control group, respectively (P〈0.05), and feed consumption did not have significant chan- ges; the feed meat ratio of rats in the treatment groups was significantly lower than that in control group ( P 〈0.05) ; the gastric relative weight and gastric weight did not change significantly, while the pH value of gastric juice of rats in treatment groups was significantly lower than that in control group (P 〈 0.05). This indicated that after transfected expression of muscle tissue, ghrelin played an important regulatory role in growth and gastric acid secretion of rats. 展开更多
关键词 recombinant Ghrelin plasmid expression Gastric growth development Gastric acid secretion Rat
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Construction and Expression of Recombinant Plasmid pCD-rbFGF in Osteoblasts
14
作者 杨操 杨述华 +1 位作者 郭晓东 屈伸 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2002年第2期109-111,共3页
Summary: To construct basic fibroblast growth factor (bFGF) eukaryotic expression vector and to evaluate the possibility of bFGF gene therapy in orthopedic disease, the pCD-rbFGF recombinant plasmid was constructed by... Summary: To construct basic fibroblast growth factor (bFGF) eukaryotic expression vector and to evaluate the possibility of bFGF gene therapy in orthopedic disease, the pCD-rbFGF recombinant plasmid was constructed by cloning rat basic fibroblast growth factor (bFGF) cDNA into an eukaryotic expression vector, pcDNA 3. Rat osteoblasts were transfected with pCD-rbFGF plasmid by lopofectin mediated gene transfer, the transient expression was detected by streptavidin-biotin-enzyme complex (SABC) method. It was observed that the expression of rat bFGF gene was detected 72 h after transfected distinctly. Basic fibroblast growth factor gene therapy is a method of potential for a wide array of orthopedic diseases. 展开更多
关键词 basic fibroblast growth factor recombinant plasmid gene transfer gene expression
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一种新型抗菌肽Cecropin B真核表达载体的构建 被引量:1
15
作者 胡仲秋 樊钰虎 +2 位作者 冯瑄 杨晓燕 边六交 《生物技术通讯》 CAS 2005年第3期268-270,共3页
通过重叠区扩增法人工设计和合成一种新型抗菌肽CecropinB基因,按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPIC9K上。经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α菌落中含有插入CecropinB基因的重组质粒pPIC9K-CB,表明成... 通过重叠区扩增法人工设计和合成一种新型抗菌肽CecropinB基因,按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPIC9K上。经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α菌落中含有插入CecropinB基因的重组质粒pPIC9K-CB,表明成功构建了新型抗菌肽CecropinB表达载体pPIC9K-CB。 展开更多
关键词 CECROPIN 抗菌肽 真核表达载体 构建 巴斯德毕赤酵母 高效表达载体 PCR鉴定 人工设计 定向克隆 序列分析 大肠杆菌 重组质粒 B基因 重叠区 CB 菌落
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人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定 被引量:1
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作者 毛爽 陈少沛 +4 位作者 颜晟 王海鹰 宁正祥 李杉 王菊芳 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2014年第9期55-59,共5页
为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达... 为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。 展开更多
关键词 抗氧化蛋白1 重组表达 亲和层析 蛋白印迹法 氧化损伤 质粒保护实验
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乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定 被引量:1
17
作者 邸洋 王茂鹏 +6 位作者 李昌 潘荣荣 荣凤君 杜寿文 朱羿龙 郭焱 金宁一 《生物技术》 CAS 北大核心 2017年第1期9-16,共8页
[目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进... [目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆。通过转化,构建重组质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX。应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测。[结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480log X+45.34,扩增效率为93.8%;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327log X+37.07,扩增效率为99.8%。[结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法。 展开更多
关键词 乳酸菌 基因编辑 重组表达质粒 gRNA CRISPR
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HBV S基因与HCV C基因嵌合真核表达质粒的构建及鉴定 被引量:1
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作者 杨赟 尹文 +3 位作者 刘建文 邓仲良 陈丽丽 欧阳颐 《实用预防医学》 CAS 2003年第2期146-148,共3页
目的 构建含HBVS基因及HCVC基因的嵌合基因真核表达质粒 ,为HBV和HCV嵌合基因疫苗研究奠定基础。 方法 PCR扩增分别获得HBVpreS1 +preS2 +S、preS2 +S、S基因片段及HCVC基因片段 ,以pcDNA3 .1 (+)为载体 ,构建同时含HBV preS1 +preS2... 目的 构建含HBVS基因及HCVC基因的嵌合基因真核表达质粒 ,为HBV和HCV嵌合基因疫苗研究奠定基础。 方法 PCR扩增分别获得HBVpreS1 +preS2 +S、preS2 +S、S基因片段及HCVC基因片段 ,以pcDNA3 .1 (+)为载体 ,构建同时含HBV preS1 +preS2 +S、preS2 +S或S基因与HCVC区基因的嵌合真核表达质粒S1S2SCpcDNA3 .1、S2SCpcDNA3 .1、SCpcDNA3 .1。  结果 经酶切鉴定及测序分析 ,所构建的嵌合表达质粒均连接正确 ,与预计一致。 结论 嵌合基因真核表达质粒的成功构建 ,将为观察嵌合基因免疫及HBV。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 联合基因 真核表达质拉 构建
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小RNA重组表达质粒转入猪体内环境释放安全性研究概况 被引量:1
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作者 寇建平 孙亚妮 +1 位作者 赵钦 周恩民 《动物医学进展》 北大核心 2015年第12期161-164,共4页
人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转... 人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转基因动物抗病育种方面得到广泛的研究,与此同时其环境释放导致的生物安全性问题也成为国际关注的重要问题。论文综述了以RNA干扰为基础的转人工miRNA抗猪蓝耳病猪在动物逃逸、环境释放以及与转入基因与宿主基因整合等方面对环境生物安全的影响,以期为猪蓝耳病NMHCⅡ-A转基因猪的进一步研究提供生物安全保障。 展开更多
关键词 重组表达质粒 基因水平转移 基因组整合 人工miRNA
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分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究 被引量:1
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作者 张红宇 李晓恒 +2 位作者 范兴 罗道泉 吴少庭 《中国热带医学》 CAS 2009年第5期787-789,840,共4页
目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法,体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因,插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,用电穿孔法将pBCG3... 目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接(Gene SOEing)法,体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因,插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,用电穿孔法将pBCG3000-CFP10-ESAT6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,SDS-PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达,Westernblot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白,可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。 展开更多
关键词 融合蛋白 CFP10 ESAT6 重组卡介苗 穿梭表达质粒
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