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添加扩增内标的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-IAC)检测创伤弧菌 被引量:7
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作者 李伟 庄濠宇 +3 位作者 温尔英 张峥嵘 黄琦容 周广彪 《检验检疫学刊》 2019年第3期5-8,共4页
根据编码创伤弧菌的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)特异性引物,以β-actin基因为内标基因,创伤弧菌gryB基因为目标基因的RPA-IAC的检测方法。37℃,恒温40min,扩增得到234bp的特异性条带及334bp的扩增内标片段,检测限可达到0.1... 根据编码创伤弧菌的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)特异性引物,以β-actin基因为内标基因,创伤弧菌gryB基因为目标基因的RPA-IAC的检测方法。37℃,恒温40min,扩增得到234bp的特异性条带及334bp的扩增内标片段,检测限可达到0.1ng/μL。方法特异性及应用测试结果均与普通PCR方法相当,特别适用于基层和现场检测。 展开更多
关键词 创伤弧菌 重组酶聚合酶扩增技术 扩增内标
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出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较
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作者 徐颖 庄国栋 +1 位作者 王丽丽 滕新栋 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期26-31,共6页
目的以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RP... 目的以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增技术 出血性大肠埃希菌O157:H7 可视化RPA 显色反应 实时荧光RPA 检测方法 食源性致病菌
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产志贺毒素大肠杆菌的RPA-LF快速检测方法的建立 被引量:2
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作者 田鑫鑫 郭容 +5 位作者 韩先干 王少辉 王权 钟国防 崔立 蒋蔚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1482-1489,共8页
为建立一种快速检测产志贺毒素大肠杆菌的基于侧流层析的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-LF)方法,以志贺毒素stx1和stx2基因序列为靶序列,设计了用于RPA-LF方法的特异性引物及探针,并对RPA-LF反应条件进行优化。结果显示,针对stx1和stx2基因... 为建立一种快速检测产志贺毒素大肠杆菌的基于侧流层析的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-LF)方法,以志贺毒素stx1和stx2基因序列为靶序列,设计了用于RPA-LF方法的特异性引物及探针,并对RPA-LF反应条件进行优化。结果显示,针对stx1和stx2基因的最佳反应温度分别为39℃和37℃,最佳反应时间分别为10 min和15 min。最佳反应条件下,stx1和stx2基因的最低检测限分别为1 pg和10 pg,灵敏度较高。该检测方法能够准确识别含stx1和/或stx2基因的大肠杆菌,且不与其他6种非目的病原菌发生交叉反应,表明本方法特异性良好。本研究建立的针对志贺毒素stx1和stx2基因的RPA-LF快速检测方法灵敏度和特异性较好,且检测时间短,结果直观可视。本试验为产志贺毒素大肠杆菌的筛选诊断和现场的快速检测开辟了一个新的途径。 展开更多
关键词 产志贺毒素大肠杆菌 stx1 stx2 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析法
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征RPA-LFD诊断方法的建立及初步应用 被引量:2
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作者 曾越琰 李超越 +1 位作者 任玉鹏 张焕容 《西南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2022年第4期379-385,共7页
高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)给我国养猪业带来了巨大的损失.为快速、便捷诊断该病,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)的HP-PRRS诊断方法.针对HP-PRRSV Nsp2基因特异序列,设计生物素(Biotin)标记的特异性引物和FA... 高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)给我国养猪业带来了巨大的损失.为快速、便捷诊断该病,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)的HP-PRRS诊断方法.针对HP-PRRSV Nsp2基因特异序列,设计生物素(Biotin)标记的特异性引物和FAM荧光素标记的探针,对RPA-LFD的反应体系和条件进行优化,结果显示,HP-PRRSV RPA-LFD最佳反应体系为:上下游引物(0.42 pmol/μL)各2.1μL,探针(0.3 pmol/μL)0.6μL,Rehydration buffer 29.5μL,cDNA模板1μL,ddH_(2)O 12.2μL,MgOAc 2.5μL,共50μL;最佳反应条件为:37℃,20 min.该方法同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332株(PRRSV VR2332)和NADC30-like株等10种常见感染猪的病原,结果显示,该方法除对HP-PRRSV检测呈阳性外,对PRRSV VR2332株、NADC30-like和其它9种感染猪的病原检测均为阴性,特异性强;该方法对10倍系列稀释的质粒标准品检测结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为4.05×10^(1)拷贝/μL,灵敏度高;该方法与HP-PRRSV商品化荧光检测试剂盒同时检测50份临床样品,二者符合率为100%.本研究首次建立了一种特异、灵敏、方便、快速、现场化的HP-PRRSV RPA-LFD检测方法,为HP-PRRS的快速诊断和流行病学调查提供了新的技术手段. 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析试纸条 即时检测
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重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA
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作者 舒佳新 陈传君 +9 位作者 谢礼 张婧 安微 杨苗 郑晶 帅培强 余姓鸿 郑巧 韩国全 林华 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2023年第7期1013-1020,共8页
目的建立非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和A型塞内卡病毒(SVA)多重重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法。方法以重组质粒为模板进行RPA检测,并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件,建立多重RPA检测方法,应用于实际样本... 目的建立非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和A型塞内卡病毒(SVA)多重重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法。方法以重组质粒为模板进行RPA检测,并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件,建立多重RPA检测方法,应用于实际样本的检测;与实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)结果对比,评价所建立方法的准确率。结果本方法可在20 min内实现对3种病毒的同时检测,特异性良好;对ASFV、PDCoV、SVA灵敏度分别为940、770、570 copies/μL;用于实际核酸样本检测,准确率分别为93.33%、100.00%、100.00%。结论本文建立的多重RPA方法快速、便捷,适合猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的现场初筛。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增技术 非洲猪瘟病毒 A型塞内卡病毒 猪Delta冠状病毒
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尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价
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作者 董文盼 杨纪潇 +3 位作者 杨项明 吕明慧 朱彦泽 蒋春号 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期665-673,共9页
[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从N... [目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列,利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析,经比对得到4个FON的特异性基因片段,并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度,然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证,最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系,并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索,得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL^(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时,只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测,5 min后即可进行结果的判断,检测下限为100 pg·μL^(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系,且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。 展开更多
关键词 西瓜枯萎病 尖孢镰刀菌西瓜专化型 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 快速检测
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空肠弯曲菌的侧向流RPA快速检测方法研究 被引量:1
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作者 刘小青 王远洋 +4 位作者 陈佳平 黄静敏 肖承荣 陈血建 陈晶 《广东化工》 CAS 2019年第14期247-248,253,共3页
目的:建立一种可现场快速检测空肠弯曲杆菌的方法。方法:应用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,设计引物探针,建立侧向流RPA法,使用特异性、灵敏性实验对该方法进行验证。结果:实验所用的所有非空... 目的:建立一种可现场快速检测空肠弯曲杆菌的方法。方法:应用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,设计引物探针,建立侧向流RPA法,使用特异性、灵敏性实验对该方法进行验证。结果:实验所用的所有非空肠弯曲菌在侧向流试剂盒上都是阴性的,空肠弯曲菌都是阳性的;该方法的检出限为1.2×10^3 CFU/mL。结论:本研究制作的RPA技术制作的侧向流试剂盒特异性和灵敏性良好,简单快捷,具有较强的应用价值。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 重组酶聚合酶等温扩增技术 侧向流RPA
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