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腺病毒介导的NT3基因转染对噪音损伤的耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用 被引量：14
1
作者 陈谦 郭维维 +4 位作者 吴燕 刘红 翟所强 汪家政 范明 《生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期263-266,共4页
神经营养素 3(neurotrophin 3,NT3)作为螺旋神经节细胞特异的营养因子 ,可有效地支持内耳传入神经元的存活 ,因此有望成为治疗因其退变而引起的感音性神经性耳聋的有效因子。实验采用腺病毒介导lacZ基因 ,检测了外源基因在豚鼠内耳中的... 神经营养素 3(neurotrophin 3,NT3)作为螺旋神经节细胞特异的营养因子 ,可有效地支持内耳传入神经元的存活 ,因此有望成为治疗因其退变而引起的感音性神经性耳聋的有效因子。实验采用腺病毒介导lacZ基因 ,检测了外源基因在豚鼠内耳中的长期表达。用噪音制备了豚鼠耳聋模型 ,在噪音损伤后第 7天 ,通过圆窗膜注入 1× 10 8重组腺病毒。注入神经营养素 3重组腺 (Ad NT3)的组为实验组 ,注入Ad lacZ的为对照组。 4周后 ,经NT3抗体免疫细胞化学染色可见 ,在注入Ad NT3病毒的实验组中 ,在内耳多种细胞中有明显的NT3蛋白的表达。HE染色显示 ,注射Ad lacZ组的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞明显退变 ,螺旋神经节内细胞间隙拉大 ,细胞密度明显低于注射Ad NT3实验组动物 (P <0 .0 1)。这一结果说明 ,腺病毒介导的NT3基因可长期表达于内耳中 ,并且可在噪音引起毛细胞死亡后有效地抑制螺旋神经节细胞的退变。 展开更多
关键词 重组腺病毒 神经营养素3 噪音 螺旋神经节
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羊口疮病毒F1L、B2L基因重组腺病毒构建及对小鼠的免疫效果分析 被引量：9
2
作者 陈晓 葛雷 +4 位作者 戴建军 李丽 张德福 吴彩凤 张树山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1701-1708,共8页
选取自剪切T2A和P2A肽,连接F1L和B2L基因,构建羊口疮病毒(orf virus,ORFV)重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价,为羊口疮的疫苗研制提供依据。应用PCR扩增ORFV-F416毒株的F1L、B2L目的基因,构建重组腺病毒穿梭质粒,穿梭质粒与骨架质粒共... 选取自剪切T2A和P2A肽,连接F1L和B2L基因,构建羊口疮病毒(orf virus,ORFV)重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价,为羊口疮的疫苗研制提供依据。应用PCR扩增ORFV-F416毒株的F1L、B2L目的基因,构建重组腺病毒穿梭质粒,穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK-293细胞,包装出ORFV重组腺病毒。将重组腺病毒感染MDBK细胞,收集上清液免疫ICR小鼠,并进行间接ELISA、淋巴细胞增殖、ORFV攻毒试验等初步评价小鼠免疫效果。结果显示:成功获得pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP重组腺病毒,其TCID_(50)为10^(-5.375)·mL^(-1),PCR和IFA检测证实目的基因在基因及蛋白水平上均有表达。ORFV重组腺病毒免疫小鼠后,其抗体水平迅速升高。ORFV重组腺病毒组对特异性抗原ORFV表现出明显的T淋巴细胞增殖能力,极显著高于PBS组(P<0.01)。本文的研究结果表明:F1L和B2L基因重组腺病毒能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且未影响小鼠正常采食,保护效力较好。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 重组腺病毒 构建 免疫效果
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超声微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs归巢大鼠缺血心肌 被引量：6
3
作者 李巧 冉海涛 +5 位作者 王志刚 钟世根 凌智瑜 李攀 李兴升 陈庆伟 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2010年第11期2030-2033,共4页
目的观察超声破坏微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植归巢大鼠缺血心肌的可行性及有效性。方法采用Percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓人脐血单个核细胞(MNCs),血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子... 目的观察超声破坏微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植归巢大鼠缺血心肌的可行性及有效性。方法采用Percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓人脐血单个核细胞(MNCs),血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)诱导培养;Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后感染体外培养的内皮祖细胞(EPCs)。将30只SD大鼠建立MI模型后随机分为5组:①空白对照组(C),②超声+微泡组(US+MB),③单纯EPCs组(EPCs),④超声+EPCs组(US+EPCs),⑤超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs)。EPCs移植后48h处死大鼠,以激光共聚焦显微镜观察大鼠心肌组织内EPCs的分布,Westernblot检测HIF-1α的表达。结果 US+MB+EPCs组绿色荧光强度高于其他各组,Westernblot显示,US+MB+EPCs组HIF-1α蛋白表达高于其他组(P<0.05)。结论超声破坏微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植可有效促进EPCs归巢,为干细胞移植治疗IHD提供了一种新的途径。 展开更多
关键词 超声检查 造影剂 重组腺病毒 内皮祖细胞 心肌梗死
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幽门螺杆菌重组腺病毒双价疫苗的构建及免疫学评价 被引量：4
4
作者 刘秀丽 刘纯杰 +3 位作者 陶好霞 李淑琴 李勣 张兆山 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第8期716-721,共6页
幽门螺杆菌 (Hp)是导致胃炎、消化道溃疡和胃癌的的主要病原菌 .利用基因重组技术 ,成功将Hp的ureB和hspA基因融合 .将ureB hspA融合基因成功构建到腺病毒载体上 .检测结果表明 ,该重组腺病毒具有侵染真核细胞能力 ,且能在真核细胞中表... 幽门螺杆菌 (Hp)是导致胃炎、消化道溃疡和胃癌的的主要病原菌 .利用基因重组技术 ,成功将Hp的ureB和hspA基因融合 .将ureB hspA融合基因成功构建到腺病毒载体上 .检测结果表明 ,该重组腺病毒具有侵染真核细胞能力 ,且能在真核细胞中表达目标抗原 .以血清中IgG和新鲜粪便中sIgA ,评价其免疫效果 ,结果显示 。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 重组腺病毒 尿素酶B 热休克蛋白A 体液免疫 黏膜免疫反应
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内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对新生血管的抑制效应 被引量：2
5
作者 潘欣 王泳 +3 位作者 张珉 赵平 潘卫 戚中田 《生物技术通讯》 CAS 2003年第5期439-443,共5页
内皮抑素与血管内皮细胞抑制因子均为内源性新生血管抑制分子。为了探讨两分子融合后的生物学功能,以重组腺病毒为载体介导融合基因在体内外表达。体外实验表明重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够在ECV304、HepG2、L929等细胞中表达41000... 内皮抑素与血管内皮细胞抑制因子均为内源性新生血管抑制分子。为了探讨两分子融合后的生物学功能,以重组腺病毒为载体介导融合基因在体内外表达。体外实验表明重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够在ECV304、HepG2、L929等细胞中表达41000大小的融合蛋白,对血管内皮细胞增殖有明显的特异性抑制作用,对HepG2和L929细胞无抑制作用(F=13112.13,P=0.0001)。体内实验表明Ad-hENDO-VEGI151重组腺病毒表达的融合蛋白可以显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成;与AdLacZ对照组相比,Ad-hENDO-VEGI151对兔炎症性角膜新生血管的抑制明显(F=1413.11P=0.0001),免疫组化结果显示,融合蛋白主要在角膜上皮层表达;治疗荷肝癌裸鼠,注射Ad-hENDO-VEGI151的肿瘤体积(487.7±241.2mm3)与AdLacZ对照组(4075.9±1849.9mm3)差异显著(F=14.80P=0.0085),抑瘤率达到88.03%,免疫组化结果显示,胞膜染色阳性,Ad-hENDO-VEGI151组肿瘤的微血管密度30.75±3.31%与AdLacZ组50.25±8.65%差异明显F=17.72P=0.0056抑制率为39%。结果提示:重组腺病毒Ad-hENDO-VEGI151能够表达有生物学活性的融合蛋白,并发挥特异性的新生血管抑制作用。 展开更多
关键词 内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子 重组腺病毒 新生血管 抑制效应 生物活性
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PCK1影响肝癌细胞迁移能力的研究 被引量：2
6
作者 向进 庹琳 +5 位作者 高庆祝 杨翼 梁利 夏杰 唐霓 汪凯 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期624-628,共5页
目的:构建编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的基因PCK1重组腺病毒和基因敲除2种细胞模型,并初步观察PCK1过表达和敲除后对肝癌细胞迁移能力的影响。方法:PCK1 c DNA克隆到p AdTrackTO4载体,构建重... 目的:构建编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的基因PCK1重组腺病毒和基因敲除2种细胞模型,并初步观察PCK1过表达和敲除后对肝癌细胞迁移能力的影响。方法:PCK1 c DNA克隆到p AdTrackTO4载体,构建重组腺病毒质粒,在HEK293细胞中包装、扩增成高滴度重组腺病毒AdPCK1;利用CRISPR/Cas9系统在PLC/PRF/5肝癌细胞系中筛选出PCK1基因敲除的稳定细胞株。首先,在过表达模型将Huh7细胞设为2组:AdGFP组和AdPCK1组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdPCK1组为感染腺病毒AdPCK1的实验组。在敲除模型设Parental组和KO组,Parental组是PLC/PRF/5细胞作为对照组,KO组是PCK1基因敲除稳定细胞株作为实验组。Western blot技术检测2种模型蛋白表达量,采用划痕实验观察细胞迁移能力,进一步经q RT-PCR检测影响肝癌细胞的迁移关键分子。结果:重组腺病毒AdPCK1构建成功,经Western blot鉴定PCK1在Huh7细胞中的表达。向导RNA(single guide RNA,sg RNA)寡核苷酸双链成功插入酶切后的Lenti CRISPR-V2质粒载体中且测序正确;经Western blot鉴定PCK1敲除的细胞株筛选成功。划痕结果显示,PCK1过表达模型在48 h的细胞迁移率为(66.300±0.383)%,与AdGFP组[(42.900±3.833)%]相比明显增加(t=10.540,P=0.000);PCK1敲除KO组在48 h的细胞迁移率为(59.40±5.68)%,与亲本细胞组[(79.00±5.20)%]相比明显减少(t=4.420,P=0.012)。q RT-PCR结果显示,PCK1过表达后,相较于对照组AdGFP,Cdh1相对表达量为2.733±0.501(t=5.989,P=0.004),相对表达增高;PCK1敲除后,相较于亲本细胞组,Cdh1相对表达量为0.664±0.017(t=34.290,P=0.000),相对表达减少。结论:PCK1过表达后可明显抑制肝癌细胞的迁移能力,而敲除后促进其迁移,证实PCK1可能作为抑癌基因参与肝癌的发生和发展。 展开更多
关键词 PCK1 重组腺病毒 CRISPR/Cas9 肝癌 迁移
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猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性抗原表位重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：2
7
作者 郭全海 陈陆 +4 位作者 王川庆 吴德峰 王永生 李志娟 王艳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1099-1102,1110,共5页
猪圆环病毒2型PCV2ORF2基因表达的Cap蛋白含有病毒的主要抗原表位,是PCV2基因工程苗研究的主要候选蛋白。根据GenBank公布的PCV2基因序列设计1对PCR引物,从感染有PCV2的PK-15细胞中扩增出包含2个特异性表位的Cap蛋白基因片段。把Cap蛋... 猪圆环病毒2型PCV2ORF2基因表达的Cap蛋白含有病毒的主要抗原表位,是PCV2基因工程苗研究的主要候选蛋白。根据GenBank公布的PCV2基因序列设计1对PCR引物,从感染有PCV2的PK-15细胞中扩增出包含2个特异性表位的Cap蛋白基因片段。把Cap蛋白基因目的基因克隆入腺病毒5型穿梭质粒中,构成重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-276。分2步把骨架质粒pAdeasy-1和重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-276分别用化学方法转化入BJ5183感受态工程菌中,同源重组后的质粒转染HEK-293A细胞,在细胞中包装出重组腺病毒。通过PCR、IPMA、免疫荧光及ELISA检测证明PCV2ORF2基因在HEK-293A中获得了表达。为PCV2的快速检测方法(检测试纸条)的建立及腺病毒活载体基因工程苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) Cap蛋白基因(ORF2基因) 腺病毒 鉴定
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猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果 被引量：1
8
作者 刘建营 丛丽媛 +4 位作者 赵路易 王建龙 王晶钰 徐维加 宋长绪 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期641-645,共5页
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和... 为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 ORF2基因 ORF1-2基因 重组腺病毒 免疫效果
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重组腺病毒Ad-DT-A靶向治疗胰岛素样生长因子2基因组印迹丢失的肿瘤细胞株 被引量：1
9
作者 潘玉琴 何帮顺 +3 位作者 朱蝉 渠利利 徐勇飞 王书奎 《中华肿瘤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期816-821,共6页
目的构建携带胰岛素样生长因子2（IGF2）印迹系统的重组腺病毒，探讨其用于肿瘤靶向治疗的可行性。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增H19enhancer、DMD以及H19启动子序列，并克隆至pDC-312中；扩增出增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和白喉毒... 目的构建携带胰岛素样生长因子2（IGF2）印迹系统的重组腺病毒，探讨其用于肿瘤靶向治疗的可行性。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增H19enhancer、DMD以及H19启动子序列，并克隆至pDC-312中；扩增出增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和白喉毒素A（DT．A）片段，分别插入到构建好的重组质粒中，构建成重组腺病毒穿梭质粒。重组腺病毒穿梭质粒与Ad5共转染，产生重组腺病毒Ad—EGFP和Ad—DT—A。以Ad—EGFP分别感染正常IGF2印迹（MOI）细胞GES．1和MCF-7以及IGF2印迹丢失（LOI）细胞HCT-8，荧光显微镜下观察各组细胞中EGFP的表达。通过检测腺病毒衣壳蛋白hexon基因的表达证实腺病毒的感染，采用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）和Western blot方法检测Ad—DT—A感染后各组细胞中DT—A基因的表达；采用四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）法和流式细胞术检测Ad—DT—A体外抗肿瘤效应。构建皮下移植瘤裸鼠模型，研究Ad-DT-A在体内的抑瘤作用。结果所构建重组腺病毒Ad-EGFP感染各组细胞后，EGFP蛋白仅在IGF2LOI细胞HCT。8中表达。各组细胞经Ad—DT—A感染后，DT-A基因仅在HCT-8细胞中表达；且HCT-8细胞以每个细胞10PFU的Ad．DT-A感染72h后，其增殖活力降低至（75．4±6．4）％，凋亡率升高至（20．8±5．9）％。Ad-DT-A多点注射人HCT-8移植瘤内，Ad—DT—A能够有效抑制移植瘤的生长，抑瘤率达36．4％。结论成功构建了携带IGF2印迹系统和DT-A基因的重组腺病毒。重组腺病毒Ad—DT-A能够有效杀伤IGF2LOI肿瘤细胞，为依赖IGF2LOI的肿瘤靶向治疗开拓了新的途径。 展开更多
关键词 GES-1细胞 MCF-7细胞 HCT HCT-8款新产品亮相BICES2011细胞 IGF2印迹 IGF2印迹丢失 靶向治疗 重组腺病毒
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包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA超声造影剂的制备及特性 被引量：1
10
作者 叶鸣 王志刚 +3 位作者 李兴升 李巧 牛诚诚 骆杰 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2010年第11期2019-2022,共4页
目的制备包载经聚乙二醇(PEG)修饰的重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α高分子超声造影剂(PLGA),以改善腺病毒载体(Adv)在体内的安全性,提高Adv基因在细胞的转染效率。方法使用活化的甲氧基PEG对重组Adv衣壳蛋白质进行修饰得到PEG化Adv(PEG-Adv)... 目的制备包载经聚乙二醇(PEG)修饰的重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α高分子超声造影剂(PLGA),以改善腺病毒载体(Adv)在体内的安全性,提高Adv基因在细胞的转染效率。方法使用活化的甲氧基PEG对重组Adv衣壳蛋白质进行修饰得到PEG化Adv(PEG-Adv),用双乳化法制备载PEG-Adv高分子超声造影剂(PLGA),观测其粒径、包封率、释放规律及释放病毒的活性,并检测其在巨噬细胞中的免疫反应程度。结果 PLGA分布均匀,平均粒径为6.23μm;包封率为17.23%;PEG-Adv和单纯Adv从PLGA释放规律相似,但从PLGA释放出来的PEG-Adv的转染效率比从PLGA释放出来的单纯Adv高;包载PEG-Adv的PLGA产生的免疫反应强度也较低。结论用PLGA微球包载PEG化的重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α,可改善Adv在体内安全性差的缺点,释放出来的病毒稳定性好,转染效率较高,作为心血管疾病的基因治疗载体具有较好的研究前景。 展开更多
关键词 重组腺病毒 聚乙二醇修饰 超声微泡 造影剂
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去甲基化酶腺病毒载体构建及其在人颌下腺细胞中的表达 被引量：1
11
作者 李莹 刘淑丹 +4 位作者 杨彦春 董世武 熊剑 李方 周继祥 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第22期2349-2352,共4页
目的构建去甲基化酶(methyl-CpG binding domain 2,MBD2)基因腺病毒载体,并观测其在人颌下腺(human submandibular gland,HSG)细胞中的表达。方法以HSG细胞总RNA为模板,RT-PCR法扩增MBD2基因全长编码序列,克隆入载体pMD18-T后,亚克隆入p... 目的构建去甲基化酶(methyl-CpG binding domain 2,MBD2)基因腺病毒载体,并观测其在人颌下腺(human submandibular gland,HSG)细胞中的表达。方法以HSG细胞总RNA为模板,RT-PCR法扩增MBD2基因全长编码序列,克隆入载体pMD18-T后,亚克隆入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack-MBD2重组体。该重组体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1于BJ5183菌中同源重组,产生重组腺病毒质粒Ad-MBD2,该质粒经293细胞包装,获得具有感染力的Ad/MBD2重组腺病毒颗粒,将该病毒颗粒感染HSG细胞,倒置显微镜检测转染后HSG细胞生长变化及MBD2在其中的表达等情况。图像分析法计算感染效率。RT-PCR法检测MBD2基因在该细胞中的表达变化。结果成功克隆到909 bp大小的MBD2基因,构建了其腺病毒载体Ad/MBD2,该腺病毒载体经293细胞成功包装,并获具感染力的Ad/MBD2重组腺病毒颗粒,其感染效率约70%。感染的HSG高表达MBD2。结论成功克隆到MBD2基因,构建了其重组腺病毒载体Ad/MBD2,并证实了其感染HSG细胞的有效表达。 展开更多
关键词 去甲基化酶基因 重组腺病毒颗粒 人颌下腺细胞
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热休克蛋白72重组腺病毒包装及其对细胞凋亡的影响 被引量：1
12
作者 鲁敏翔 祝成亮 +3 位作者 宋惠 李毅 刘芳 刘兴晖 《中国动脉硬化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期273-276,共4页
目的包装热休克蛋白72重组腺病毒表达载体,探讨其对ECV304细胞凋亡的影响。方法采用细菌同源重组法构建了热休克蛋白72重组腺病毒表达载体;流式细胞仪检测重组腺病毒对细胞凋亡的影响;荧光报告系统和蛋白印迹分析重组腺病毒对p53转录的... 目的包装热休克蛋白72重组腺病毒表达载体,探讨其对ECV304细胞凋亡的影响。方法采用细菌同源重组法构建了热休克蛋白72重组腺病毒表达载体;流式细胞仪检测重组腺病毒对细胞凋亡的影响;荧光报告系统和蛋白印迹分析重组腺病毒对p53转录的调节和蛋白表达的影响。结果成功包装了热休克蛋白72重组腺病毒,热休克蛋白72能够促进细胞凋亡,从转录水平上调p53蛋白的表达。结论热休克蛋白72可能通过上调p53蛋白的表达促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 热休克蛋白72 腺病毒包装 凋亡 动脉粥样硬化
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SREBP-1c基因重组腺病毒的构建及其在犊牛原代肝细胞中的表达
13
作者 杨文涛 丁红研 +14 位作者 付世新 邓清华 宋玉祥 史晓霞 张璐莹 张仁和 郭立辉 刘芳宁 刘兆喜 李心慰 陈灰 张良 赵晨旭 李小兵 王哲 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期670-674,共5页
将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用XbaⅠ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用HindⅢ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoRⅤ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上。经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和... 将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用XbaⅠ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用HindⅢ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoRⅤ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上。经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-CeuⅠ+I-SceⅠ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac I酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度。以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP-1cmRNA和蛋白的表达量。结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1cmRNA和蛋白的表达显著升高。结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达。 展开更多
关键词 SREBP-1C 重组腺病毒 牛肝细胞1
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hVEGF_(165)四环素调控腺病毒载体的构建及其在大鼠成肌细胞表达
14
作者 黄新苗 秦永文 +4 位作者 沈茜 吴弘 陈少萍 周菲 游晓华 《心脏杂志》 CAS 2006年第1期35-38,42,共5页
目的构建表达人血管内皮生长因子165基因(hVEGF165)的四环素调控重组腺病毒,并测定其在原代培养大鼠成肌细胞的表达水平。方法亚克隆hVEGF165全长cDNA到穿梭质粒pTREShuttle2,获得四环素可调控的目的基因表达盒;亚克隆表达盒到BDAdeno-X... 目的构建表达人血管内皮生长因子165基因(hVEGF165)的四环素调控重组腺病毒,并测定其在原代培养大鼠成肌细胞的表达水平。方法亚克隆hVEGF165全长cDNA到穿梭质粒pTREShuttle2,获得四环素可调控的目的基因表达盒;亚克隆表达盒到BDAdeno-XTMViralDNA,获得重组腺病毒质粒;重组质粒转染HEK293细胞以包装产生具有感染能力的重组腺病毒颗粒AdTRE.VEGF165。hVEGF165重组腺病毒和Tetoff调节病毒共感染原代培养的成肌细胞,酶联免疫法检测目的基因的表达。结果成功构建了能表达hVEGF165的四环素调控的重组腺病毒载体。hVEGF165重组腺病毒(20pfu/cell)和Tetoff调控病毒(20pfu/cell)共感染骨骼肌成肌细胞后5d,ELISA检测显示培养上清中VEGF165蛋白浓度显著高于未感染的细胞培养上清[(14.80±1.15ng/ml)×105/(cell·24h)vs(1.39±0.36ng/ml)×105/(cell·24h),P<0.01)]。结论四环素调控表达的腺病毒系统可高效地转导VEGF基因进入哺乳动物细胞;原代培养的骨骼肌成肌细胞感染AdTRE.VEGF165后可高水平地分泌VEGF165蛋白。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 成肌细胞 重组腺病毒 基因治疗
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干扰原代Leydig细胞糖皮质激素受体表达的重组腺病毒构建研究
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作者 陈勇 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1307-1311,共5页
目的:获得可对原代大鼠Leydig细胞的糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)产生干扰作用的含miRNA的重组腺病毒。方法:首先设计并构建针对大鼠GR基因的4对miRNA表达载体,将此4种miRNA表达载体经脂质体转染大鼠胚胎成纤维细胞(Rat ... 目的:获得可对原代大鼠Leydig细胞的糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)产生干扰作用的含miRNA的重组腺病毒。方法:首先设计并构建针对大鼠GR基因的4对miRNA表达载体,将此4种miRNA表达载体经脂质体转染大鼠胚胎成纤维细胞(Rat embryonic fibroblast,REF),Western blot分析GR的表达变化,筛选出干扰效果最佳的miRNA表达质粒。其次通过BP重组和LR重组,构建重组腺病毒质粒。最后将重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装扩增并检测腺病毒滴度,将合适滴度的重组腺病毒感染原代大鼠Leydig细胞,Western blot法检测重组腺病毒干扰原代大鼠Leydig细胞GR表达的效果。结果:重组腺病毒感染Leydig细胞的效率可达80%,与对照组相比,感染重组腺病毒的Leydig细胞,其GR蛋白表达显著减少。结论:本研究成功构建重组腺病毒,证实其对原代大鼠Leydig细胞中GR的表达具有特异性干扰效应。 展开更多
关键词 糖皮质激素受体 RNA干扰 重组腺病毒 LEYDIG细胞
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大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA与orfC重组腺病毒的制备及应用
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作者 张优优 徐坤 +5 位作者 王亮亮 张婷婷 辛颖 任充华 闫强 张智英 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第12期34-40,共7页
【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC... 【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的影响。【结果】PCR扩增获得了891bp的orfA基因和360bp的orfC基因,成功构建了对照空载体pAdEasy-l-CK和含有orfA和orfC基因的腺病毒载体pAdEasy-l-orfA和pAdEasy-l-orfC,转染HEK293细胞并进行包装后获得了重组腺病毒Ad-CK、Ad-orfA和Ad-orfC,用Hela229细胞测得其滴度分别为5.67×109,2.00×109和7.33×108 GFU/mL。重组腺病毒对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用。【结论】初步证明了orfA和orfC基因对人类肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用,为进一步研究WDSV辅助基因对人类肿瘤的影响以及肿瘤萎缩的分子机理奠定了基础。 展开更多
关键词 大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒 orfA基因 orfC基因 重组腺病毒 肿瘤
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MiR-22重组腺病毒的构建及对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响
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作者 廖立红 袁文彬 +1 位作者 陈勇 梁继超 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期763-771,共9页
文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭... 文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22,最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3轮扩增后感染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测miR-22表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-22对HepG2细胞SIRT1在蛋白质水平的表达及GSK-3β磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR检测miR-22对PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表达的影响。结果表明,重组腺病毒Ad-miR-22感染显著增加HepG2细胞miR-22表达水平。此外,Ad-miR-22显著抑制胰岛素诱导的HepG2葡萄糖摄取,并通过下调GSK-3β磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用,并下调SIRT1基因在蛋白质水平的表达。综上所述,构建了miR-22的重组腺病毒,发现其显著增加糖异生,抑制HepG2细胞葡萄糖摄取,该作用可能与miR-22调节SIRT1在蛋白质水平的表达有关。 展开更多
关键词 miR-22 重组腺病毒 葡萄糖摄取 糖异生 基因治疗 SIRT1
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高表达trip-1蛋白对大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响
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作者 张茜 葛远龙 +2 位作者 伍姝 王中原 黄来强 《现代生物医学进展》 CAS 2013年第7期1201-1204,共4页
目的:研究上调大鼠肾小管上皮细胞中trip-1蛋白的表达量对TGF-β1诱导的上皮细胞转分化的影响。方法:包装人TRIP-1基因重组腺病毒,用其感染NRK52E细胞36 h上调内源性trip-1蛋白表达量,之后用10 ng/ml的TGF-β1对细胞进行刺激诱导,72 h后... 目的:研究上调大鼠肾小管上皮细胞中trip-1蛋白的表达量对TGF-β1诱导的上皮细胞转分化的影响。方法:包装人TRIP-1基因重组腺病毒,用其感染NRK52E细胞36 h上调内源性trip-1蛋白表达量,之后用10 ng/ml的TGF-β1对细胞进行刺激诱导,72 h后做Western Blot检测细胞中E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白表达量。结果:①包装的人TRIP-1基因重组腺病毒感染细胞能够有效上调细胞中trip-1蛋白的表达量。②上调细胞中trip-1蛋白表达量,对TGF-β1引起的NRK52E细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低有所抑制,但对TGF-β1引起的NRK52E细胞中α-SMA蛋白表达水平升高没有明显调节作用。结论:上调大鼠肾小管上皮细胞中trip-1蛋白的表达量在一定程度上抑制了TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化。 展开更多
关键词 重组腺病毒 肾纤维化 上皮细胞转分化 TRIP-1 TGF-β1
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胰岛素样生长因子1对全氟异丁烯吸入性肺损伤小鼠防护作用的研究 被引量：3
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作者 李蓓 陈力 +4 位作者 马劲夫 赵建 尹明 丁日高 黎檀实 《中国危重病急救医学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期219-221,I0002,共4页
目的观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对小鼠全氟异丁烯（PFIB）吸入性急性肺损伤（ALI）模型的防护作用并探讨其可能机制。方法64只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组（A组）、吸入PFIB染毒组（B组）、染毒前7d气管内滴入携带IGF-1基因的... 目的观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对小鼠全氟异丁烯（PFIB）吸入性急性肺损伤（ALI）模型的防护作用并探讨其可能机制。方法64只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组（A组）、吸入PFIB染毒组（B组）、染毒前7d气管内滴入携带IGF-1基因的重组腺病毒5载体（Ad5-IGF-1）干预组（C组）、空载腺病毒对照组（D组）。使用小鼠动态吸入PFIB全身暴露染毒实验装置对小鼠进行染毒，观察各组小鼠的肺系数、支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量、血清及肺组织中IGF-1含量，光镜下观察肺组织病理学变化及透射电镜下观察肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATI）的变化。结果与A组比较，其他各组小鼠的肺湿／干重（W／D）比值、含水量及BALF中总蛋白含量显著增高（P均〈0．01）；C组小鼠肺W／D比值、含水量及BALF中白蛋白和总蛋白含量均较B组和D组显著下降（P均〈0．01）；B组、D组血清IGF-1含量显著低于A组，而C组IGF-1含量明显高于A、B、D组（P均〈0．01），B、C、D组肺组织匀浆中IGF-1含量较A组明显升高（尸均〈0．01），且C组显著高于B组和D组（P均〈0．01）。光镜下观察C组小鼠肺组织内透明膜形成，弥漫性肺泡不张、水肿液积聚、红细胞渗出、大量中性粒细胞及巨噬细胞聚集等病变较B组和D组明显改善；C组ATⅡ超微结构可见微绒毛脱落、细胞核皱缩、染色质致密、线粒体肿胀、双层膜结构破坏、基质空泡等改变也较B组和D组改善。结论Ad5一IGF-1对小鼠PFIB吸入性ALI具有预防作用，可以显著降低肺W／D比值、含水量及BALF中蛋白含量，提高血清及肺组织中IGF-1的含量，保护ATI是IGF-1发挥作用的可能机制。 展开更多
关键词 全氟异丁烯 重组腺病毒5 胰岛素样生长因子1 急性肺损伤
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表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：3
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作者 陈廷炜 孟宪踊 +3 位作者 王铁成 高玉伟 冯娜 夏咸柱 《野生动物学报》 北大核心 2021年第3期747-754,共8页
为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-T... 为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H,然后与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组,获得重组质粒pAd-CDV-H;重组质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-CDV-H,连续传代后对获得的重组腺病毒分别进行病毒滴定、免疫荧光和Western blot鉴定。经免疫荧光方法及Western blot鉴定结果表明,重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞、Vero细胞后均可以成功表达H蛋白,获得的重组腺病毒的滴度高达1010IFU/mL。成功获得能够表达大熊猫源CDV H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H,在进一步证明其安全有效后,可为大熊猫犬瘟热免疫预防提供候选疫苗株。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 H基因 复制缺陷型重组腺病毒 大熊猫源
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