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羽衣甘蓝S_(13-b)位点受体激酶基因的克隆及激酶结构域的原核表达 被引量：1
1
作者 蓝兴国 杨佳 +1 位作者 王艳红 李玉花 《生物技术通讯》 CAS 2010年第2期210-212,共3页
目的:分离羽衣甘蓝S13-b位点受体激酶(SRK13-b)基因并进行序列及结构域分析,构建SRK13-b结构域的原核表达载体并进行重组蛋白质的原核表达和纯化。方法:提取羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系花期柱头的RNA,用RT-PCR法分离SRK13-b基因;将... 目的:分离羽衣甘蓝S13-b位点受体激酶(SRK13-b)基因并进行序列及结构域分析,构建SRK13-b结构域的原核表达载体并进行重组蛋白质的原核表达和纯化。方法:提取羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系花期柱头的RNA,用RT-PCR法分离SRK13-b基因;将编码SRK13-b激酶结构域的序列插入大肠杆菌表达载体pET-14b中,构建原核表达质粒pET-SRK13-bCT,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株,经0.1mmol/LIPTG诱导,用Ni-NTA亲和层析柱对SRK13-b激酶结构域蛋白进行纯化。结果:分离获得羽衣甘蓝SRK13-b基因的长度为2571bp,编码856个氨基酸,GenBank收录号为EU180597;对SRK13-b激酶结构域蛋白进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE显示相对分子质量约43×103的蛋白质特异表达,对表达产物进行分离纯化,获得了SRK13-b激酶结构域的融合蛋白。结论:羽衣甘蓝SRK13-b基因的克隆及激酶结构域的原核表达,为研究SRK的功能及自交不亲和性奠定了基础。 展开更多
关键词 羽衣甘蓝 自交不亲和 S13-b位点受体激酶 原核表达 纯化
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sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定 被引量：6
2
作者 王广兰 宫璀璀 +5 位作者 王文丽 刘亚利 王轩 高天蓝星 刘珊 陈雷 《实用医药杂志》 2008年第8期970-973,977,共5页
目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴... 目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。 展开更多
关键词 可溶性补体受体1型 原核表达载体 包涵体 纯化 复性 生物学活性
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鼠表皮生长因子受体胞外段原核表达、纯化与复性 被引量：2
3
作者 胡兵 田聆 +4 位作者 卢铀 杨莉 赵霞 刘继彦 魏于全 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 2003年第2期264-267,共4页
用多聚酶链反应 (PCR)方法从既往构建质粒扩增鼠表皮生长因子受体 (EGFR)胞外段基因及适宜酶切位点 ,进而构建原核表达载体。克服质粒丢失的不足 ,在大肠杆菌中表达目的蛋白 ,并在变性条件下通过 Ni2 +柱亲和层析纯化表达蛋白 ,聚丙烯... 用多聚酶链反应 (PCR)方法从既往构建质粒扩增鼠表皮生长因子受体 (EGFR)胞外段基因及适宜酶切位点 ,进而构建原核表达载体。克服质粒丢失的不足 ,在大肠杆菌中表达目的蛋白 ,并在变性条件下通过 Ni2 +柱亲和层析纯化表达蛋白 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)示纯度在 95 %以上。去除组氨酸标记的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。复性蛋白在表皮生长因子的作用下可以同源二聚化而在非还原 SDS- PAGE及蛋白印迹分析中呈二聚体状态 ,其所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于肺癌细胞上的 EGFR,提示复性后大肠杆菌表达鼠EGFR胞外段重组蛋白已获得一定空间结构 ,并具有免疫原性 ,可以进一步用于 展开更多
关键词 表皮生长因子受体 原核表达 纯化 同源二聚化 免疫原性 基因扩增 胞外段 肿瘤
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家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达 被引量：1
4
作者 罗娟 陈恩祥 +7 位作者 刘红玲 彭芷昕 杨从文 沈关望 张海燕 邢润苗 林英 夏庆友 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第19期3922-3928,共7页
【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR),分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到... 【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR),分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵(scanty vitellin,vit)的LBD1+EGF1结构域(C11D和C11V)片段,连接到细胞表达载体上,通过细胞转染表达目的蛋白,采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况;通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白,以包涵体形式表达;镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白,进一步切胶纯化后,以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体,其抗体效价>1﹕512 000,纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达;在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段,家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失;细胞免疫组化试验表明,突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达;制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白,表明试验所制备的VgR抗体特异性较好;由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽,细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中,Western blot对培养液进行蛋白检测,表明突变型vit存在氨基酸缺失,但并不影响肽蛋白的正常表达,且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的 展开更多
关键词 家蚕 卵黄原蛋白受体 原核表达 细胞表达
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肉毒毒素蛋白受体sytIIN端片段基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达 被引量：1
5
作者 史晶 王慧 +2 位作者 包士中 侯晓军 荫俊 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期17-20,共4页
旨在构建肉毒毒素蛋白受体sytIIN端片段的原核表达载体,并在大肠杆菌pMAL-c2x系统中表达MBP-Syt融合蛋白。根据GenBank中已报道的人sytII基因序列,截取N端氨基酸序列,依据大肠杆菌的偏爱密码子,设计引物人工合成全基因,将全长基因克隆... 旨在构建肉毒毒素蛋白受体sytIIN端片段的原核表达载体,并在大肠杆菌pMAL-c2x系统中表达MBP-Syt融合蛋白。根据GenBank中已报道的人sytII基因序列,截取N端氨基酸序列,依据大肠杆菌的偏爱密码子,设计引物人工合成全基因,将全长基因克隆至原核表达载体pMAL-c2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli ER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Amylose Resin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和免疫印记对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析,为进一步研究毒素与受体相互作用的机制奠定基础。 展开更多
关键词 肉毒毒素 受体 MBP融合蛋白 原核表达
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表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定 被引量：1
6
作者 石玉生 张兴梅 李妍 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1891-1893,共3页
目的克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFRECD),构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;... 目的克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFRECD),构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用SalI和NotI双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右。经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究。 展开更多
关键词 表皮生长因子受体 原核表达 融合蛋白
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人催乳素受体胞外区蛋白的原核表达及纯化
7
作者 刘雪瑶 鲁雅洁 +4 位作者 屈芫 姚俊 魏钦俊 曹新 冯振卿 《生物技术通讯》 CAS 2010年第1期7-11,共5页
目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接... 目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG诱导重组工程菌表达,使用谷胱甘肽偶联的GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-hPRLR融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为37.6×103处有一条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-hPRLR融合蛋白,为进一步研究催乳素受体的功能和制备特异性的抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 人催乳素受体 融合蛋白 原核表达 纯化
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