目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线...目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。展开更多
金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立...金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.展开更多
文摘目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
文摘金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.
