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重组蛋白药物游离巯基荧光法检测方法探索、优化及验证
1
作者 刘振东 高晗 +3 位作者 江楠 杨勇 王庆民 安振明 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1533-1542,共10页
目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测,首先对蛋白变性条件进行摸索优化,确定了变性剂种类及变性条件,并采用重组蛋白药物进行了方法验证,结果均符合... 目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测,首先对蛋白变性条件进行摸索优化,确定了变性剂种类及变性条件,并采用重组蛋白药物进行了方法验证,结果均符合验证标准。但在采用该方法对我公司PEG-GCSF和KGF产品(分子序列中理论均含有1 mol巯基/mol蛋白)进行检测时,发现游离巯基检测值均显著低于理论值,检测值最高仅为理论值的29%,可能与蛋白分子内部包埋的游离巯基未充分暴露有关。因此,本研究在已有分析方法的基础上采用蛋白酶酶解的方式,充分暴露蛋白分子中的游离巯基,并对样品的酶切条件及其他关键参数进行了优化,对优化后的分析方法进行了方法学验证。结果:通过筛选,确定了最佳变性条件:终浓度为8 mol·L^(-1)尿素37℃孵育30 min。针对已知理论游离巯基含量的重组蛋白1(PEG-GCSF)和重组蛋白2(KGF)产品游离巯基检测值明显低于理论值的问题,采用蛋白酶切方式,酶切条件为蛋白酶K酶切(目的蛋白):蛋白酶K(20∶1,w:w),37℃孵育1 hr,酶解后检测巯基实测值与理论值一致。经验证该方法实测结果RSD均<15%;各浓度的加标回收率均在80%~120%范围内;在1~15μmol·L^(-1)游离巯基范围内线性良好-1定量限(LOQ)为1μmol·L^(-1),各项验证指标均符合验证标准,满足检测需求。结论:本研究采用蛋白酶酶切的方式进行样品前处理,充分暴露重组蛋白药物分子内包埋的游离巯基,解决了复杂重组蛋白药物产品中游离巯基无法准确定量的难题,为该类蛋白分子中微量游离巯基的定量测定和表征研究提供了方法和参考。 展开更多
关键词 重组蛋白药物 游离巯基 荧光法 蛋白酶切 已知巯基含量重组蛋白 方法优化 方法验证
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颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平变化及意义 被引量：8
2
作者 黄永健 麦玲 +4 位作者 罗婷 王崇科 方孟秋 何咸锰 黄毅 《山东医药》 CAS 2023年第10期31-35,共5页
目的探讨颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清半胱氨酸蛋白酶裂解细胞角蛋白-18(CCCK-18)、神经轴突向导因子-1(Netrin-1)、乙酰肝素酶(HPA)水平变化及意义。方法选取200例颅内动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血患者,根据患者血管内... 目的探讨颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清半胱氨酸蛋白酶裂解细胞角蛋白-18(CCCK-18)、神经轴突向导因子-1(Netrin-1)、乙酰肝素酶(HPA)水平变化及意义。方法选取200例颅内动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血患者,根据患者血管内介入术后是否发生慢性脑积水分为发生组52例与未发生组148例。比较两组临床资料及血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平,Logistic回归分析颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水的影响因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价CCCK-18、Netrin-1、HPA对颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水的预测价值,比较不同血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平患者生存预后情况。结果发生组年龄、Hunthess分级及Fisher分级与未发生组比较差异有统计学意义(P均<0.05);发生组术后第1、3、7天血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平均高于对照组(P均<0.05);Logistic回归分析结果显示,CCCK-18、Netrin-1、HPA均为颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水发生的影响因素(P均<0.05);CCCK-18、Netrin-1、HPA联合预测颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水的AUC为0.927,较单一指标预测AUC大(P均<0.05);术后第3天CCCK-18、Netrin-1、HPA高水平患者30 d内病死率高于低水平患者(P均<0.05)。结论颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平较高,联合检测有助于慢性脑积水预测及预后评估。 展开更多
关键词 颅内动脉瘤 血管内介入术 慢性脑积水 半胱氨酸蛋白酶裂解细胞角蛋白-18 神经轴突向导因子-1 乙酰肝素酶
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胆石症患者血清微小RNA-122、高迁移率族蛋白1和角蛋白-18水平及其临床意义 被引量：3
3
作者 程铁军 张明智 《实用肝脏病杂志》 CAS 2019年第2期285-288,共4页
目的探讨胆石症患者血清微小RNA-122(miR-122)、高迁移率族蛋白1(HMGB 1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋白-18(CCK-18)水平变化及其临床意义。方法 2015年1月～2018年2月我院收治的201例胆石症患者和健康体检者103例,比较两组人群血... 目的探讨胆石症患者血清微小RNA-122(miR-122)、高迁移率族蛋白1(HMGB 1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋白-18(CCK-18)水平变化及其临床意义。方法 2015年1月～2018年2月我院收治的201例胆石症患者和健康体检者103例,比较两组人群血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平差异。采用Logistic回归分析影响单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的相关因素。采用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析血清指标诊断复杂性胆石症的效能。结果胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平分别为4.7(0.9,14.3)、(2.5±0.7) ng/mL和(126.8±20.5)U/L,显著高于健康人【0.9(0.4,3.1)、(2.1±0.4) ng/mL和(101.4±18.7) U/L,均P<0.05】;97例单纯性胆石症组血清miR-122、HMGB 1和CCK-18分别为3.5(0.7,8.5)、(2.2±0.5)ng/m L和(112.4±19.4)U/L,显著低于104例复杂性胆石症组【分别为5.8(0.9,16.2)、(2.8±0.8) ng/m L和(140.2±23.5) U/L,均P<0.05】;单因素和多因素Logistic回归分析显示,肝硬化、腹腔积液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18为单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的危险因素;血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平三者联合检测诊断复杂性胆石症的AUC为0.819(0.758～0.962),显著高于miR-122【0.724(0.657～0.815)】、HMGB 1【0.701(0.633～0.804)或CCK-18【0.767(0.702～0.873)】单指标检测。结论对血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高的胆石症患者,应想到复杂性胆石症的可能,而给予更仔细的检查和特别处理。 展开更多
关键词 胆石症 复杂性胆石症 微小RNA-122 高迁移率族蛋白1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋-18
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人卵透明带蛋白3差异表达菌的鉴定及比较
4
作者 周文燊 熊波 +4 位作者 李文星 谢琪璇 肖銮娟 张春雪 潘善培 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期117-122,共6页
目的:研究重组人卵透明带ZP3蛋白的差异表达情况。方法:构建8个重组rhZP3的差异表达质粒在毕赤酵母中进行诱导表达,研究跨膜区保留与否、潜在酶切位点突变与否及多聚组氨酸纯化标签设计的位置是否影响rhZP3的表达情况。结果:保留跨膜区... 目的:研究重组人卵透明带ZP3蛋白的差异表达情况。方法:构建8个重组rhZP3的差异表达质粒在毕赤酵母中进行诱导表达,研究跨膜区保留与否、潜在酶切位点突变与否及多聚组氨酸纯化标签设计的位置是否影响rhZP3的表达情况。结果:保留跨膜区会影响重组蛋白泌出胞外而使表达量降低,潜在酶切位点存在会导致重组蛋白被不完全降解,而多聚组氨酸纯化标签设计位置对表达也有一定影响。结论:从表达量和产物完整性综合考虑,以突变型成熟肽为佳,含跨膜区的蛋白则应选用pPICZaA质粒,以便富集得到完整的表达蛋白。 展开更多
关键词 重组人卵透明带ZP3蛋白 表达 跨膜区 酶切位点突变 组氨酸纯化标签
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蛋白质组末端肽富集策略研究进展 被引量：2
5
作者 陈玲凡 单亦初 +1 位作者 张丽华 张玉奎 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期229-236,共8页
蛋白质的末端不仅是蛋白质合成的起点和终点,更参与并调节蛋白质的各项生理功能。研究蛋白质的末端不仅对于蛋白质的结构和功能注释十分必要,还为揭示蛋白酶的作用机理提供重要信息。该文着重针对近年来蛋白质组末端肽富集策略方面取得... 蛋白质的末端不仅是蛋白质合成的起点和终点,更参与并调节蛋白质的各项生理功能。研究蛋白质的末端不仅对于蛋白质的结构和功能注释十分必要,还为揭示蛋白酶的作用机理提供重要信息。该文着重针对近年来蛋白质组末端肽富集策略方面取得的进展进行综述,并对蛋白质末端组学技术在蛋白酶作用底物和位点分析中的应用进行了概述。此外,还对蛋白质末端组学研究的发展前景进行了展望。 展开更多
关键词 蛋白质末端组学 末端肽富集 蛋白酶作用底物和位点 综述
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