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重组苦荞麦过敏蛋白TBa的原核表达及其免疫活性鉴定 被引量:24
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作者 王岚 李玉英 +2 位作者 蔡桂红 张政 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期308-312,共5页
TBa[tartary buckwheat allergen]是苦荞麦中的一种主要过敏蛋白.根据长度为585bp的TBacDNA序列,以pET-28a为表达载体并选择合适的酶切位点合成上、下游引物,采用基因克隆技术构建重组表达载体pET-28a-TBa.进一步将重组质粒转入大肠杆菌... TBa[tartary buckwheat allergen]是苦荞麦中的一种主要过敏蛋白.根据长度为585bp的TBacDNA序列,以pET-28a为表达载体并选择合适的酶切位点合成上、下游引物,采用基因克隆技术构建重组表达载体pET-28a-TBa.进一步将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.从而获得以包涵体形式存在的TBa目的蛋白.该目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化及SDS-PAGE分析显示,纯度达到95%以上.用透析复性的方法将目的蛋白重折叠,其复性产率可达到约68%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.ELISA检测表明,通过基因重组及表达获得的重组苦荞麦过敏蛋白,与天然苦荞种子中的该蛋白具有相似的免疫学活性,与荞麦过敏病人血清中的IgE有特异性的结合. 展开更多
关键词 苦荞麦 过敏蛋白 原核表达 免疫活性
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狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量:12
2
作者 高明华 夏咸柱 薛琳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期31-34,共4页
目的用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)... 目的用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达载体pET-N。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的最佳诱导时间。通过凝胶薄层扫描分析和Western-blot分析确定表达蛋白的表达量和特异性。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对各反应条件的优化,初步建立检测RV抗体的间接ELISA方法。结果扩增了RV N基因,构建了原核表达载体pET-N和原核表达菌,表达了N基因且目的蛋白以包涵体形式存在表达菌中,最佳诱导时间为4 h。重组蛋白表达量占菌体总蛋白的56.8%,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病重组N蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了狂犬病核蛋白,用表达的狂犬病核蛋白建立的间接ELISA方法可以用于RV抗体的检测。 展开更多
关键词 狂犬病毒ERA株 核蛋白基因 原核表达 间接ELISA
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胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析 被引量:7
3
作者 王春来 刘思国 +3 位作者 王牟平 彭永刚 宫强 孔宪刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期63-66,共4页
猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因... 猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ毒素 原核表达 免疫原性
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蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的原核表达及纯化 被引量:10
4
作者 王洋 余源 +5 位作者 王卫亮 陈阳 慈雅丽 田喜凤 郑佳 杨志宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期465-469,共5页
目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT-PCR获得α-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),构建成为重组表达载体pET-28a(+)-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS... 目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT-PCR获得α-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),构建成为重组表达载体pET-28a(+)-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-α-4,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在;SDS-PAGE及Western blot分析显示,在相对分子量约34 kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的重组的α-4贾第素融合蛋白。结论成功克隆、表达并纯化了α-4贾第素蛋白,为α-4贾第素的细胞定位及功能研究提供了必要条件。 展开更多
关键词 蓝氏贾第鞭毛虫 α-4贾第素 原核表达
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正交试验在人乳头瘤病毒16型E2蛋白原核表达优化中的应用 被引量:8
5
作者 商庆龙 马延秀 +5 位作者 郭志伟 李立群 郝美丽 孙宇辉 魏兰兰 谷鸿喜 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第5期988-991,共4页
鉴定人乳头瘤病毒(HPV)16型E2蛋白的重组表达菌株,通过正交试验快速优化诱导表达条件,增加目的蛋白的表达量。应用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达后的蛋白。选取诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度OD600和诱导温度共4个主要外部因素... 鉴定人乳头瘤病毒(HPV)16型E2蛋白的重组表达菌株,通过正交试验快速优化诱导表达条件,增加目的蛋白的表达量。应用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达后的蛋白。选取诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度OD600和诱导温度共4个主要外部因素。采用四因素两水平正交试验设计,以单位体积内HPV16 E2目的蛋白含量作为检测指标,结果用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果表明,HPV16 E2菌株鉴定正确。HPV16 E2蛋白表达主要以不溶性蛋白为主,主要影响因素是诱导剂浓度和诱导温度,最佳诱导条件为37℃、1.0 mmol/L IPTG和OD600为1.0的条件下诱导7 h,正交试验对分子生物学反应的影响因素分析和条件优化有借鉴意义。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16型E2蛋白 正交试验 原核表达 条件优化
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奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达 被引量:4
6
作者 周雷 张勇 +1 位作者 王建锋 赵兴绪 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期7-10,共4页
根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体... 根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白. 展开更多
关键词 奶牛 β-防御素5 基因克隆 原核表达
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人工合成的脑心肌炎病毒VP1表位基因在大肠杆菌中的表达与抗原性测定 被引量:5
7
作者 韩研妍 姜平 +1 位作者 顾小雪 李玉峰 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期100-103,共4页
在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。经过GSTr... 在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。经过GSTrap FF亲和层析柱获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30 800。以该纯化蛋白免疫家兔,获得效价分别为1∶25 600和1∶1 600的抗血清。W estern-b lot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带。结果表明:脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位区150 bp编码基因在E.coli中获得正确表达,纯化后的蛋白具有抗原性。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP1蛋白抗原表位 原核表达 抗原性
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猪源Mx1基因的原核表达及其抗血清制备 被引量:7
8
作者 何丹妮 周斌 +3 位作者 张小敏 陈溥言 庞然 赵津 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期87-91,共5页
利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达... 利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带。结论:poMx1基因表达成功。 展开更多
关键词 猪源Mx1基因 原核表达 抗血清
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橡胶树2个胶乳转化酶基因的原核表达 被引量:5
9
作者 刘术金 李旖璠 唐朝荣 《热带作物学报》 CSCD 2010年第7期1091-1097,共7页
转化酶是控制橡胶树胶乳蔗糖代谢和影响胶乳(橡胶)产量的关键酶。将已克隆的2个橡胶树胶乳转化酶基因(HbNIN1、HbNIN2)的编码区插入到原核表达载体pET28a上,经酶切和测序鉴定,成功获得了读框准确的转化酶表达载体(pET-HbNIN1和pET-HbNIN... 转化酶是控制橡胶树胶乳蔗糖代谢和影响胶乳(橡胶)产量的关键酶。将已克隆的2个橡胶树胶乳转化酶基因(HbNIN1、HbNIN2)的编码区插入到原核表达载体pET28a上,经酶切和测序鉴定,成功获得了读框准确的转化酶表达载体(pET-HbNIN1和pET-HbNIN2);再将表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),对其培养温度、IPTG诱导浓度和培养时间进行优化表达。结果表明,携带2个转化酶基因表达载体(pET-HbNIN1和pET-HbNIN2)的大肠杆菌转化子分别在28℃和37℃条件下,经浓度1.0 mmol/L IPTG诱导6 h实现了目标蛋白(HbNIN1和HbNIN2)的原核高效表达,表达量大于菌体总蛋白的20%,目标蛋白主要以包涵体形式存在。该结果为进一步研究这2种转化酶蛋白的分子特性和抗体制备奠定基础。 展开更多
关键词 橡胶树 转化酶 载体构建 原核表达
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鸡肌抑素基因的原核表达及蛋白纯化 被引量:5
10
作者 蓝赐华 刘为民 梁梓森 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第7期18-20,共3页
利用实验室保存的重组质粒pMD18-MSTN重新构建原核表达质粒pET-32a-MSTN,将其转化到宿主菌大肠杆菌BL21上并进行诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化。结果表明:该基因在宿主菌中成功表达;目的蛋白被成功纯化,且纯度较高。
关键词 南海黄鸡 肌抑素基因 原核表达 蛋白纯化
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肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆表达及活性分析 被引量:5
11
作者 冉旭华 李晓娟 +3 位作者 李树东 王春仁 朴范泽 闻晓波 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期891-894,共4页
目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切... 目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后转入E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对该重组蛋白进行分析和鉴定。结果成功获得肝片吸虫GST基因全长为657bp的编码序列,SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量为31.3kDa,以包涵体形式表达。Western blotting结果证实重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能与感染肝片吸虫的绒山羊血清发生反应,表明重组蛋白具有免疫反应性。结论成功的克隆了肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因,实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,并具有良好的免疫学活性。 展开更多
关键词 肝片吸虫 谷胱甘肽S-转移酶基因 原核表达
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重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达 被引量:5
12
作者 常艺海 丛丽娜 卢冬 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2012年第6期391-394,共4页
根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,... 根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。 展开更多
关键词 溶菌酶 原核表达 克隆 海参
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猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立 被引量:5
13
作者 陆欣然 华思红 +4 位作者 樊钰莹 白文顺 杜敏 孙永科 杨玉艾 《动物医学进展》 北大核心 2017年第4期28-34,共7页
为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 04... 为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 NS3基因 原核表达 蛋白纯化 间接ELISA
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水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达 被引量:4
14
作者 谢体三 农微 +3 位作者 张新民 黄雅琼 崔奎青 石德顺 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第8期14-17,共4页
采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定。序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基... 采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定。序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质。将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达。在1 mmol/L IPTG中,37℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达。将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku。 展开更多
关键词 抑制素α亚基 水牛 原核表达
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人胱抑素C的原核表达及包涵体复性研究 被引量:4
15
作者 李江峰 钱伟 +1 位作者 王继华 才蕾 《药物生物技术》 CAS 2015年第5期396-399,共4页
构建胱抑素C原核表达载体p Cold1-cysc,p ET28a-cysc,p ET32a-cysc和p ET41a-cysc及相应的BL21(DE3)表达菌株,最终得到重组人胱抑素C蛋白。应用基因工程手段,原核表达,亲和层析及透析复性的方法对目的蛋白进行表达,纯化和复性。结果:经... 构建胱抑素C原核表达载体p Cold1-cysc,p ET28a-cysc,p ET32a-cysc和p ET41a-cysc及相应的BL21(DE3)表达菌株,最终得到重组人胱抑素C蛋白。应用基因工程手段,原核表达,亲和层析及透析复性的方法对目的蛋白进行表达,纯化和复性。结果:经分析后,选取表达量较大的菌株BL21(DE3)p ET32a-cysc和BL21(DE3)p Cold1-cysc,对目的蛋白进行提取及纯化,对纯化后的可溶及包涵体形式的重组胱抑素C进行透析复性及免疫活性的检测。Western blotting及ELISA结果显示,携带有不同融合标签的可溶性重组胱抑素C或包涵体在透析复性后具有不同的免疫活性。结论:在大肠杆菌中成功表达并得到人胱抑素C的蛋白,复性后得到了重组胱抑素C的活性形式。 展开更多
关键词 胱抑素C 原核表达 重组蛋白 包涵体 复性
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油菜中—未知BnRCH蛋白的E3连接酶活性分析 被引量:4
16
作者 陈存 唐天元 +3 位作者 杨虹伟 蔡黎 杨毅 李旭锋 《四川大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期1159-1163,共5页
利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RING-variant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTK-BnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GST-BnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外... 利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RING-variant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTK-BnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GST-BnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外泛素反应体系,发现BnRCH在ATP、泛素、E1、E2存在的条件下,能催化多聚泛素化形成,具有E3连接酶活性. 展开更多
关键词 BnRCH 原核表达 E3连接酶
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日本血吸虫信号通路相关基因SjWD101的生物信息学分析及其克隆与表达 被引量:3
17
作者 刘玲 陈守义 +4 位作者 余新炳 赵宇 黄灿 胡旭初 徐劲 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期4-8,共5页
目的利用生物信息学方法分析日本血吸虫SjWD101的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆和表达,获得相应的重组蛋白。方法从日本血吸虫GenBank数据库中筛选WD家族蛋白中全长基因,用相关软件进行生物信息学预测。通过RT-PCR扩增出... 目的利用生物信息学方法分析日本血吸虫SjWD101的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆和表达,获得相应的重组蛋白。方法从日本血吸虫GenBank数据库中筛选WD家族蛋白中全长基因,用相关软件进行生物信息学预测。通过RT-PCR扩增出全长编码区序列,克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,表达产物用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)鉴定。结果SjWD101是一个全长1085bp的基因,编码区为66~950,编码294个氨基酸,软件分析表明其理论分子量和等电点分别是31819.7Da和6.44.亚细胞定位分析表明该蛋白是胞浆蛋白,理化性质较稳定。二级结构以反向平行的β折叠为主。含有6个WD40结构域,属于WD蛋白家族中的一员,具有GTP结合蛋白的结构特征。经PCR、双酶切和测序证实pET-28a(+)-SjWD101构建成功。SDS-PAGE和Western blotting证实重组菌成功表达出融合蛋白,经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实WD101重组蛋白能被感染日本血吸虫的兔血清识别。结论日本血吸虫WD101经生物信息学预测为WD家族蛋白,可能在血吸虫信号转导通路方面有其一定作用,本研究获得了纯化的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 WD40结构域 生物信息学 克隆 表达
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鸡缩胆囊素-33串联体的构建、原核表达及免疫原性研究 被引量:4
18
作者 舒鼎铭 覃健萍 +1 位作者 曹永长 毕英佐 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期96-99,共4页
根据鸡缩胆囊素(choleystok in in,cck)-33基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子,设计了大肠杆菌表达系统偏爱的cck基因序列.将cck-33基因克隆至pRSET A质粒上,利用载体上的同尾酶构建cck基因四串联体并在大肠杆菌E.coliBL 21中成功表达... 根据鸡缩胆囊素(choleystok in in,cck)-33基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子,设计了大肠杆菌表达系统偏爱的cck基因序列.将cck-33基因克隆至pRSET A质粒上,利用载体上的同尾酶构建cck基因四串联体并在大肠杆菌E.coliBL 21中成功表达.将所表达的融合蛋白进行纯化后,以纯化的蛋白为免疫原制备油佐剂疫苗主动免疫胡须肉鸡.结果表明,CCK蛋白主动免疫肉鸡后,抗血清水平显著升高,P/N值远远大于2. 展开更多
关键词 缩胆囊素 串联体 原核表达 免疫原性
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扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析 被引量:4
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作者 张亮 李疆 +3 位作者 代培红 罗淑萍 李鹏 彭弯弯 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期612-617,共6页
为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,... 为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。 展开更多
关键词 扁桃 CBF1转录因子 原核表达
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抑制新城疫病毒繁殖的九肽及其突变体基因的克隆与原核表达 被引量:2
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作者 谢俊秋 张庆华 +2 位作者 张雪燕 姚海燕 韩跃武 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第8期662-664,668,共4页
目的克隆并表达抑制新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽(Nonapeptide)及其突变体基因。方法设计并合成Non-apeptide2串联体及其突变体基因,克隆于质粒pUC18,经酶切回收目的基因,与经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛... 目的克隆并表达抑制新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽(Nonapeptide)及其突变体基因。方法设计并合成Non-apeptide2串联体及其突变体基因,克隆于质粒pUC18,经酶切回收目的基因,与经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定。IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。阳性重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约29000处可见一明显条带,与理论值相符。Nonapeptide 2及其突变体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的41%和37%。Western blot结果显示两种蛋白均具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了抗NDV繁殖的Nonapeptide及其突变体基因。 展开更多
关键词 新城疫病毒 九肽 突变体 克隆 原核表达
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