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PRRSV M蛋白基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立 被引量:5
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作者 罗忠永 王印 杨泽晓 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期95-99,共5页
利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-EL... 利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-ELISA和IDEXX Herd Chek ELISA for PRRSV试剂盒检测收集的400份临床血清样品。结果,用PCR扩增到了PRRSV M基因,获得了重组M蛋白,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA(M-ELISA);该M-ELISA具有良好的特异性和重复性。400份临床血清的检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果的符合率为95.3%。上述结果表明,本研究基于表达的重组M蛋白,成功建立了检测RRSV抗体的间接ELISA。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 M蛋白基因 原核表达 N-ti-ELISA
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一个深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆与表达 被引量:2
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作者 崔锦锦 季秀玲 +2 位作者 林连兵 魏云林 张琦 《生命科学研究》 CAS CSCD 2017年第3期208-212,256,共6页
根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumiga... 根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumigates)线粒体苹果酸脱氢酶的相似性最高,达71.26%,且含有苹果酸脱氢酶的保守辅酶结合位点、底物结合位点和催化活性位点。将MIMDH2片段连接到表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-MIMDH2,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示在50 k D左右处有一蛋白质条带,酶活分析结果显示经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白酶活高达271.33 U/mg。以上结果说明所克隆的MIMDH2为一个新的潜在的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的活性。 展开更多
关键词 深黄被孢霉 苹果酸脱氢酶(MDH) 基因克隆 序列分析 原核表达
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三七PnAAE41基因的克隆、表达分析及原核表达 被引量:1
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作者 闫静 向贵生 +3 位作者 冯垒 杨梅 郭敏 张广辉 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2021年第7期1868-1875,共8页
草酰辅酶A合成酶参与了三七主要止血活性成分三七素的生物合成,研究三七草酰辅酶A合成酶基因(PnAAE41)的分子特征及表达特征,从而完善三七素生物合成途径以及成分积累调控机制等方面的研究。以三七为材料,在前期转录组研究基础上,设计... 草酰辅酶A合成酶参与了三七主要止血活性成分三七素的生物合成,研究三七草酰辅酶A合成酶基因(PnAAE41)的分子特征及表达特征,从而完善三七素生物合成途径以及成分积累调控机制等方面的研究。以三七为材料,在前期转录组研究基础上,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增获得1个三七AAE基因的cDNA全长。采用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析PnAAE41基因的时空表达特异性。通过异源表达探索PnAAE41蛋白最佳的诱导条件,随后以颜色反应作为定性研究的基础。序列分析结果表明,PnAAE41的开放阅读框长度为1572 bp,编码523个氨基酸,登录号为MW242343。系统进化分析显示,PnAAE41蛋白与拟南芥AtAAE蛋白亲缘关系最近。预测PnAAE41蛋白主要定位于细胞质膜上,不含信号肽序列,二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占大部分比例。qRT-PCR分析表明,PnAAE41基因主要在根和茎中优势表达。异源表达最佳诱导条件为0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16℃诱导9 h,该蛋白对草酸具有催化作用。本研究结果为进一步深入研究AAE在三七素生物合成途径中的功能提供理论基础。 展开更多
关键词 三七 草酰辅酶A合成酶 生物信息学分析 时空表达 原核表达
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Expression and Identification of Mycoplasma penetrans P35 Lipoprotein
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作者 朱翠明 吴移谋 +1 位作者 万艳平 余敏君 《Chinese Journal of Sexually Transmitted Infections》 2004年第2期110-114,i004,i005,共7页
Objective: To study the biological activity of Myco-plasma penetrans 35kDa lipoprotein(P35) in vitro, prokaryotic expression vector pQE31//p35 was constructed and recombinant fusion protein P35 (rP35) was expressed in... Objective: To study the biological activity of Myco-plasma penetrans 35kDa lipoprotein(P35) in vitro, prokaryotic expression vector pQE31//p35 was constructed and recombinant fusion protein P35 (rP35) was expressed in E.coli. Methods: The p35 gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR), cloned to pQE31, and a positive clone was screened. PCR-mediated mutagenesis was used to change the two "TGA" triplets to "TGG" triplets within the p35 gene. Production of the recombinant protein was induced by the addition of IPTG to the E.coli culture. rP35 was purified with a Ni-NTA Spin Kit and rP35 purification was analyzed by Western blot. Results: About 1Kb PCR amplification was cloned into pQE31. The two "TGA" triplets within the p35 gene were successfully changed to "TGG" triplets. The pQE31/p35 vector expressed a protein with a calculated molecular mass of 37.4kDa in E.coli. Western blot indicated the 37.4kDa protein was rP35 . Conclusion: PQE31/p35, a prokaryotic expression vector containing p35 gene, was successfully constructed and expressed in E.coli. 展开更多
关键词 Mycoplasma penetrans P35 prokary-otic cell expression
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抗血管生成肽βpep-25重组原核表达质粒的构建及鉴定
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作者 李恩孝 刘陕西 +3 位作者 杨广笑 王全颖 吴胤瑛 施璠 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期154-156,160,共4页
目的:合成抗血管生成肽βpep-25片断,构建并鉴定含βpep-25肽的重组原核表达质粒。方法:人工设计合成βpep-25肽序列片断,经测序正确后,利用基因克隆技术将其克隆到pGEM-Teasy载体中,构建重组质粒pGEM-T-βpep-25;用NaeI和BamHI双酶切pG... 目的:合成抗血管生成肽βpep-25片断,构建并鉴定含βpep-25肽的重组原核表达质粒。方法:人工设计合成βpep-25肽序列片断,经测序正确后,利用基因克隆技术将其克隆到pGEM-Teasy载体中,构建重组质粒pGEM-T-βpep-25;用NaeI和BamHI双酶切pGEM-T-βpep-25后,将T-βpep-25肽片断克隆到经NaeI和BamHI双酶切的重组载体pBV220-NT4中,构建重组原核表达质粒pBV220-NT4-βpep-25,并对其分别用BamHI酶切,EcoRI和BamHI双酶切分析。结果:经酶切分析和DNA测序人工合成的肽βpep-25序列(113bp)与文献报道结果一致;分别用BamHI酶切,EcoRI和BamHI双酶切重组原核表达质粒pBV220-NT4-βpep-25可以得到4030bp、364bp和3666bp的片段,结果表明目的肽片段已经成功地克隆到了重组表达载体中,说明重组原核表达质粒构建成功。结论:抗血管生成肽βpep-25重组原核表达质粒的构建成功,为进一步在细胞内外及动物模型研究其作用机制和抗肿瘤作用奠定了基础。 展开更多
关键词 抗血管生成 βpep-25 原核表达载体
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细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测 被引量:1
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作者 吴巨龙 王绚 +4 位作者 吕刚 苏娟 逯召莲 孙萃萍 景涛 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期125-129,共5页
目的以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性。方法运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树... 目的以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性。方法运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树和二级结构、三级结构等方面进行分析后,将EgGAPDH基因亚克隆于表达载体pET30a(+),转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,表达、纯化重组蛋白,并利用底物3-磷酸甘油醛测定重组蛋白EgGAPDH的酶催化活性。结果 EgGAPDH cDNA序列长度为1 011bp,编码一个336个氨基酸的蛋白。该GAPDH蛋白理论相对分子质量为36 128.3Da,等电点为8.44,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域,富含6种类型的特定功能位点。成功构建的原核表达载体pET30a(+)-EgGAPDH在E.coli BL21(DE3)中高效表达,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清,制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活检测显示其具有高效酶活性。结论 EgGAPDH基因可在原核系统中获得有酶催化活性的高效表达,为进一步研究其在糖代谢中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 细粒棘球绦虫 甘油醛3-磷酸脱氢酶 生物信息学 原核表达 酶活性检测
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