新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析 被引量：6

1

作者 温纳相 陈瑞爱 +4 位作者 裴仉福 唐满华 金晓芹 魏志清 朱文冠 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第1期64-66,共3页

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL 18)基因序列,设计了1对特异引物。利用RT PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增,获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序,证实已获得了新兴猪IL 18成熟蛋白基因片段,其大... 根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL 18)基因序列,设计了1对特异引物。利用RT PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增,获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序,证实已获得了新兴猪IL 18成熟蛋白基因片段,其大小为474bp,编码157个氨基酸,与GenBank上登录的猪IL 18成熟蛋白基因序列完全一致。 展开更多

关键词 猪IL-18基因 克隆 序列分析

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猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测 被引量：6

2

作者 郑兰兰 贾云飞 +3 位作者 崔保安 陈红英 魏战勇 陈瑞亮 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期214-219,共6页

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18... 通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中,构建重组质粒pGEX-IL18,转化E.coli BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白,占菌体总蛋白的28%左右,以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤,用MTT法测定表明,重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。 展开更多

关键词 猪白细胞介素18 成熟蛋白 原核表达 活性检测

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猪白细胞介素-18基因表达及重组蛋白的纯化 被引量：3

3

作者 裴仉福 陈瑞爱 +5 位作者 唐秀英 朱文冠 唐满华 李琳 程含波 温纳相 《中国兽药杂志》 2007年第2期5-9,共5页

以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,... 以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,并命名为pET41c-IL18和pET32c-IL18。将pET41c-IL18和pET32c-IL18转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。SDS-PAGE及W estern-blotting分析结果表明,所表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,pET32c-IL18重组蛋白分子质量约33 ku,与预期大小相符。将包涵体提取物用8 mol/L脲变性,经N i-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。 展开更多

关键词 猪白细胞介素-18 基因表达 蛋白纯化

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河南良杂猪白细胞介素-18成熟蛋白基因的克隆及表达载体的构建 被引量：3

4

作者 郑兰兰 崔保安 +3 位作者 贾云飞 陈瑞亮 陈红英 吕晓丽 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期200-203,共4页

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18基因成熟蛋白序列.序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基... 采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18基因成熟蛋白序列.序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-IL18,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确. 展开更多

关键词 猪IL-18基因 克隆 成熟蛋白 表达载体

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猪IL-18在杆状病毒/昆虫细胞中的表达 被引量：1

5

作者 王振亚 王彦彬 +5 位作者 陈红英 邵攀峰 宁晓东 潘娜 韩利静 崔保安 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期118-123,共6页

IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后... IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。 展开更多

关键词 猪白细胞介素-18 昆虫细胞 表达

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三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析 被引量：1

6

作者 曹素芳 李明 +4 位作者 王岩 刘长斗 朱赞梅 唐桂芬 肖松云 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第6期2413-2415,共3页

[目的]为进一步研发新型抗病毒制剂和疫苗佐剂、有效控制猪重大传染病奠定基础。[方法]根据GenBank中猪白细胞介素-18基因(IL-18)序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR方法从河南三元杂交猪脾脏淋巴细胞中扩增猪IL-18基因,并进行克隆、序... [目的]为进一步研发新型抗病毒制剂和疫苗佐剂、有效控制猪重大传染病奠定基础。[方法]根据GenBank中猪白细胞介素-18基因(IL-18)序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR方法从河南三元杂交猪脾脏淋巴细胞中扩增猪IL-18基因,并进行克隆、序列测定和分析。[结果]猪IL-18基因全长为579 bp,编码192个氨基酸的无活性前体蛋白,但前体蛋白并不含典型的疏水信号肽,在第35位氨基酸残基处有1个潜在的白细胞介素1β转换酶(ICE)剪切位点,剪切后变为具有生物活性的猪IL-18成熟蛋白。序列分析结果表明,该试验获得的猪IL-18基因与已知猪IL-18基因序列同源性很高,均为96%以上,其推导的氨基酸同源性在98%以上。[结论]该研究成功构建了猪IL-18基因的重组真核表达载体并得到了具有生物活性的瞬时表达产物。 展开更多

关键词 猪 白细胞介素-18 序列测定 同源性

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猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达

7

作者 郑兰兰 崔保安 +3 位作者 陈红英 贾云飞 陈瑞亮 方忠意 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期75-79,共5页

RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-TpIL18,转化E.coliJM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核... RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-TpIL18,转化E.coliJM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在. 展开更多

关键词 猪白细胞介素18 成熟蛋白 原核表达

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猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

8

作者 邵攀峰 崔沛 +3 位作者 郑兰兰 魏战勇 盛敏 崔保安 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第12期85-90,共6页

【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL... 【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。 展开更多

关键词 猪白细胞介素18 真核表达 生物学活性 猪流感灭活疫苗

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猪IL-18在酵母中表达及活性检测

9

作者 曹素芳 祁画丽 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第6期32-35,共4页

以pGEMT/pIL-18为模板,应用PCR法扩增出猪IL-18基因,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,插入酵母表达载体pPICZαA中,经酶切、PCR扩增及序列测定,成功构建了酵母重组表达载体pPICZ/pIL-18,电击转化毕赤酵母X-33,应用Zeocin筛选获得高拷贝重组转... 以pGEMT/pIL-18为模板,应用PCR法扩增出猪IL-18基因,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,插入酵母表达载体pPICZαA中,经酶切、PCR扩增及序列测定,成功构建了酵母重组表达载体pPICZ/pIL-18,电击转化毕赤酵母X-33,应用Zeocin筛选获得高拷贝重组转化菌株,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析重组pIL-18蛋白的表达,并用Sephadex G-200纯化表达的重组pIL-18蛋白。运用MTT法检测其生物学活性。试验结果表明,重组X-33酵母菌株能够表达分泌性pIL-18,诱导72h表达量最高,其表达量占总蛋白表达量的38%。而且纯化的重组pIL-18蛋白具有明显促进淋巴细胞增殖的活性。 展开更多

关键词 猪 白细胞介素18 毕赤酵母 生物活性

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猪IL-18成熟蛋白基因重组真核表达载体的构建及其抗病毒作用研究

10

作者 曹素芳 王岩 《郑州牧业工程高等专科学校学报》 2011年第3期1-5,共5页

应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体... 应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体pcDNA3.1,成功构建了pmIL-18基因的重组真核表达载体pcD-NA3/pmIL-18。将重组质粒转染COS7细胞,经SDS-PAGE及Western-blotting分析表明,pmIL-18基因在COS7细胞中获得了瞬时表达。收集转染细胞培养上清,检测pmIL-18抗病毒活性,结果表明,转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒没有明显的抑制作用。 展开更多

关键词 猪 白细胞介素-18 真核表达载体 抗病毒活性

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猪白介素-18基因的克隆及其序列分析 被引量：29

11

作者 景志忠 窦永喜 +2 位作者 侯俊琳 蒙学莲 才学鹏 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2004年第7期3-7,共5页

通过对猪PBMC刺激诱导 ,提取总RNA ,然后采用RT PCR技术克隆了猪白介素 18(pIL 18)基因。序列分析结果表明 ,克隆的 pIL 18基因序列与GenBank上登录的 pIL 18基因序列完全一致 ,与其他各物种的IL 18基因间具有较大的种属差异性。该基... 通过对猪PBMC刺激诱导 ,提取总RNA ,然后采用RT PCR技术克隆了猪白介素 18(pIL 18)基因。序列分析结果表明 ,克隆的 pIL 18基因序列与GenBank上登录的 pIL 18基因序列完全一致 ,与其他各物种的IL 18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL 展开更多

关键词 猪白介素-18基因 克隆 RT-PCR 同源性分析

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猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化 被引量：1

12

作者 裴仉福 陈瑞爱 +5 位作者 温纳相 唐秀英 唐满华 朱文冠 李琳 程含波 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期842-846,共5页

以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ+SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接... 以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ+SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2+-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 猪白细胞介素-18基因 原核表达 蛋白纯化

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猪白细胞介素-18基因克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

13

作者 郑兰兰 崔保安 +5 位作者 陈红英 贾云飞 陈瑞亮 方忠意 李小康 赵丽 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期41-46,共6页

采集6月龄河南良杂猪脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18全基因序列。序列测定表明,plL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码192个氨基酸。与GenBank... 采集6月龄河南良杂猪脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18全基因序列。序列测定表明,plL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码192个氨基酸。与GenBank上已发表序列ABO10003进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处(以ATG为1计)存在A→G的有意义突变。与从GenBank下载读取的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%、98.5%和99.8%、99%。将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA-ILl8m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为核酸疫苗的研究应用奠定了基础。 展开更多

关键词 猪IL-18基因 克隆 表达载体

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