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pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化 被引量：19
1
作者 董晓 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《郧阳医学院学报》 2005年第6期321-325,F0003,共6页
目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性... 目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 TA克隆载体 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化
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质粒pcDNA3-HGF的大规模纯化制备研究 被引量：9
2
作者 张庆林 毕建进 +7 位作者 高春蕾 齐子荣 郭树华 哈小琴 宋京 龚萍 王小娜 吴祖泽 《生物技术通讯》 CAS 2000年第4期268-270,共3页
质粒pcDNA3 HGF具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒DNA应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括 :发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Q SepharoseXL捕获质粒DNA、Source 15Q精制质粒DNA ,所得纯... 质粒pcDNA3 HGF具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒DNA应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括 :发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Q SepharoseXL捕获质粒DNA、Source 15Q精制质粒DNA ,所得纯超螺旋质粒pcDNA3 HGF符合质量标准。 展开更多
关键词 质粒 纯化 制备 肝细胞生长因子 基因治疗
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亚微米生物功能磁性复合微球的构建及在质粒DNA捕获中的应用 被引量：5
3
作者 雷涵 邓乐 朱文杰 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2002年第8期75-80,共6页
采用分散聚合法 ,以Mn Zn铁磁体为磁核 ,苯乙烯 丙烯酸共聚物为高分子壳层 ,合成了表面带羧基的磁性高分子微球。通过比较微球与有机试剂 (酚 /氯仿 )纯化分离质粒DNA的效果 ,得出结论 :前者具有安全、低耗、快速。
关键词 亚微米生物功能磁性复合微球 捕获 分散聚合 Mn-Zn铁磁体 磁性高分子微球 质粒DNA 纯化分离
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BAC文库构建中的几个技术问题探讨 被引量：7
4
作者 陈凡国 姜涛 张学勇 《生物技术》 CAS CSCD 2002年第2期28-29,共2页
构建BAC文库有两个关键环节 :一是载体的克隆 ;二是HMW(highmolecularweight)DNA的制备。针对这两个问题 。
关键词 BAC文库 质粒纯化 HMW 野生一粒小麦 大片断DNA 载体 基因文库
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一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法 被引量：6
5
作者 李云峰 邵国 +1 位作者 苏燕 李丽莉 《包头医学院学报》 CAS 2000年第2期144-145,共2页
介绍一种快速获取高纯度质粒 DNA方法 ,在碱裂解法快速获取质粒 DNA粗制品的基础上 ,利用一种不溶解蛋白质而溶解 DNA的溶液 TES纯化质粒 DNA,同时对本法所提取的质粒的 DNA的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易 ,所得样品纯度... 介绍一种快速获取高纯度质粒 DNA方法 ,在碱裂解法快速获取质粒 DNA粗制品的基础上 ,利用一种不溶解蛋白质而溶解 DNA的溶液 TES纯化质粒 DNA,同时对本法所提取的质粒的 DNA的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易 ,所得样品纯度高 ,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。 展开更多
关键词 质粒 脱氧核糖核酸 纯化 提取
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治疗用质粒DNA的纯化工艺 被引量：5
6
作者 丛艳昭 鲁承 +9 位作者 金宁一 申镇维 梁晓枫 金洪涛 白靓 牟伟锋 于长勇 常巧呈 齐楷 金明杰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第10期899-902,共4页
目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测... 目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。 展开更多
关键词 质粒DNA 纯化 中空纤维柱 层析
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质粒DNA碱裂解提取法的改进 被引量：5
7
作者 王义华 徐梅珍 +1 位作者 于学平 贺浩华 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 2002年第6期851-853,共3页
对质粒的碱裂解小量提取法进行了改进 ,改进的方法克服了以往质粒提取方法的RNA等杂质污染和操作烦琐费时等问题 ,该方法操作简单、经济实用 ,提取的质粒DNA得率稳定、质量好 ,符合大多数分子生物学常规实验的要求。
关键词 质粒DNA 碱裂解 提取法 改进 纯化
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质粒DNA实验室规模化制备工艺 被引量：1
8
作者 贲培玲 陈容前 +1 位作者 孙淼 施向阳 《山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报》 CAS 2023年第3期202-208,共7页
目的 探索实验室规模生产质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)的制备工艺。方法 选用质粒pEGFP-N1E. coli Stbl3菌株,用最陡爬坡试验(plackett-burman,PB)筛选出影响质粒产量最显著因素,响应面法优化重组菌高产发酵条件。采用碱裂解,浓缩质粒,通... 目的 探索实验室规模生产质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)的制备工艺。方法 选用质粒pEGFP-N1E. coli Stbl3菌株,用最陡爬坡试验(plackett-burman,PB)筛选出影响质粒产量最显著因素,响应面法优化重组菌高产发酵条件。采用碱裂解,浓缩质粒,通过凝胶、亲和、离子等层析分离纯化pDNA,并对所纯化的pDNA进行质量评价。结果 用PB试验和响应面试验设计筛选出的关键因素是:酵母提取物20 g/L,甘油6 g/L,接种物浓度吸光度(optical density,OD)=0.014。在最佳条件下进行3次平行发酵,生物量OD 600达28.07±2.01,质粒产量(21.34±1.31)mg/L。pDNA纯度(A260 nm/A280 nm)为1.91±0.02。内毒素含量小于0.005 EU/g DNA;几乎检测不到蛋白质及细菌基因组DNA残留,达到相关质量标准。结论 本研究采用的制备工艺可生产出高质量的p DNA。 展开更多
关键词 质粒DNA 响应面 实验室规模发酵 纯化 质量评价
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经典碱裂解法质粒大量提取方法的改良 被引量：5
9
作者 孟宇 李静 +4 位作者 孙智峰 李玉恒 李昌盛 林增 李士泽 《黑龙江八一农垦大学学报》 2012年第2期33-35,共3页
利用滤膜过滤技术对经典碱裂解法进行改良,并将改良后的提取效果与经典碱裂解法和试剂盒法进行比较。结果表明,改良法提取的质粒DNA浓度显著高于经典碱裂解法和试剂盒法,并且质粒纯度与试剂盒法相近。改良方法适用于实验室的应用与推广。
关键词 碱裂解法 质粒DNA 提取与纯化 滤膜过滤
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氯化锂离心纯化质粒DNA方法的建立及其效果评价 被引量：3
10
作者 王淳本 尤颖健 +1 位作者 陶莎 屈伸 《中国优生与遗传杂志》 1996年第1期10-12,共3页
本文建立了一种采用氯化锂离心纯化质粒ＤＮＡ的方法。该法不需要特殊的仪器设备和昂贵的试剂材料，操作简便易行。用此法对ｐＵＣ和ｐＧＥＭ等多种系统的质粒进行了提取纯化。结果表明：纯化的质粒ＤＮＡ无ＲＮＡ、蛋白质和染色质ＤＮ... 本文建立了一种采用氯化锂离心纯化质粒ＤＮＡ的方法。该法不需要特殊的仪器设备和昂贵的试剂材料，操作简便易行。用此法对ｐＵＣ和ｐＧＥＭ等多种系统的质粒进行了提取纯化。结果表明：纯化的质粒ＤＮＡ无ＲＮＡ、蛋白质和染色质ＤＮＡ污染，其得率与氯化铯超离心法相近；酶切效果良好；可直接用于哺乳动物细胞的基因转移并获得有效表达。 展开更多
关键词 DNA 提纯 氯化锂 质粒
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CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定 被引量：3
11
作者 苏敬阳 王蓉蓉 +7 位作者 袁媛 李松霖 朱正南 黄露婷 封瑞 邵冬雪 孙雪菲 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期97-101,共5页
目的制备钙调蛋白(CaM)突变体CaM_(E141G)的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融... 目的制备钙调蛋白(CaM)突变体CaM_(E141G)的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,Pre Scission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaM_(E141G)蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性。结果提取纯化后的CaM_(E141G)蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1.2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaM_(E141G)蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1.2钙通道结合的能力。结论成功构建了CaM_(E141G)融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaM_(E141G)蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1.2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 钙调蛋白 突变体 质粒 表达纯化 pull-down实验
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一种有效纯化低拷贝质粒DNA的改良硅藻土法 被引量：3
12
作者 余宏傲 张岚岚 徐昌杰 《细胞生物学杂志》 CSCD 2005年第6期679-683,共5页
碱法制备的低拷贝质粒因含有大量杂质而无法获得有效的测序结果。为此,以纯λDNA为样品,对硅藻土纯化DNA的方法进行了优化,表明硅藻土悬液的最佳用量是20μl/μgλDNA,回收率达77.31%。应用此改良硅藻土法纯化一长为14953bp的低拷贝质粒... 碱法制备的低拷贝质粒因含有大量杂质而无法获得有效的测序结果。为此,以纯λDNA为样品,对硅藻土纯化DNA的方法进行了优化,表明硅藻土悬液的最佳用量是20μl/μgλDNA,回收率达77.31%。应用此改良硅藻土法纯化一长为14953bp的低拷贝质粒pLZ14,所得质粒纯度达23.87%,比未纯化前提高了11.06倍。经纯化的pLZ14质粒测序信号强、无误认碱基,而未经纯化的质粒测序时信号弱、错误普遍存在。 展开更多
关键词 硅藻土 盐酸胍 质粒 DNA纯化
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大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化 被引量：2
13
作者 王友如 《生物技术》 CAS CSCD 2006年第6期42-44,共3页
目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除... 目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。 展开更多
关键词 质粒 DNA提取 方法改进 纯化
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pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化 被引量：2
14
作者 刘文华 肖祥华 +4 位作者 施产甫 徐根兴 傅更锋 樊燕蓉 刘新卷 《南京军医学院学报》 2003年第3期148-150,共3页
目的:探索pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化工艺。方法:碱裂解法提取质粒后,用0.4 mol/L CaCl2沉淀除去RNA,再用Q-Sepharose XL进行初纯,SOURCE 15Q精纯。所得纯化物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定超螺旋质粒的含量。结果:经此方法纯化的pcDN... 目的:探索pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化工艺。方法:碱裂解法提取质粒后,用0.4 mol/L CaCl2沉淀除去RNA,再用Q-Sepharose XL进行初纯,SOURCE 15Q精纯。所得纯化物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定超螺旋质粒的含量。结果:经此方法纯化的pcDNA3-内皮抑素质粒中超螺旋质粒的含量可达95％以上,且无RNA检出。结论:该法可以实现pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化。 展开更多
关键词 质粒 纯化 内皮抑素
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CTAB选择性沉淀和纯化质粒DNA工艺的建立 被引量：2
15
作者 张泉 于可响 +3 位作者 袁维峰 薛方明 孙怀昌 朱鸿飞 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期2117-2121,共5页
通过直接在大肠杆菌碱裂解上清中加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），优化CTAB与质粒DNA量的比例、质粒DNA选择性释放溶液的选择和TritonX－114的使用，建立了简单、易行的大规模质粒DNA纯化工艺。纯化质粒DNA的质量检测结果显示，CTAB... 通过直接在大肠杆菌碱裂解上清中加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），优化CTAB与质粒DNA量的比例、质粒DNA选择性释放溶液的选择和TritonX－114的使用，建立了简单、易行的大规模质粒DNA纯化工艺。纯化质粒DNA的质量检测结果显示，CTAB纯化的质粒DNA无菌体RNA污染，菌体基因组DNA、内毒素和蛋白含量分别小于100ng／mg、50EU／mg和10μg／mg质粒DNA，OD260／OD280比值介于1．75－1．85之间，超螺旋质粒DNA的比例大于80％，该工艺纯化的质粒DNA能达到或接近FDA规定的人用质粒DNA的各项指标，整个过程不使用动物源性酶和苯酚、氯仿、无水乙醇等有毒或易燃、易爆试剂，成本低廉，工艺环保。 展开更多
关键词 十六烷基三甲基溴化铵 质粒DNA 纯化 质量检测
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治疗用质粒DNACTAB纯化工艺的优化 被引量：2
16
作者 陈婷 刘嘉 +1 位作者 王晓 刁勇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第10期1502-1507,共6页
目的优化治疗用质粒DNA十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)纯化工艺,为其规模化生产奠定基础。方法采用碱裂解法裂解含质粒pEGFP的大肠埃希菌(E.coli)DH5α菌种,在碱裂解液中加入不同终浓度的CTAB及不同终浓度... 目的优化治疗用质粒DNA十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)纯化工艺,为其规模化生产奠定基础。方法采用碱裂解法裂解含质粒pEGFP的大肠埃希菌(E.coli)DH5α菌种,在碱裂解液中加入不同终浓度的CTAB及不同终浓度的NaCl、KAc、LiCl、CaCl2、MgCl2溶液,确定CTAB纯化质粒DNA的最佳浓度,并分析盐对质粒DNA选择性释放的影响。分别采用BCA蛋白浓度测定试剂盒、内毒素检测试剂盒和Real time-PCR法检测纯化的质粒DNA中宿主蛋白含量、内毒素含量和细菌基因组DNA含量;通过A549细胞及动物转染试验检测纯化质粒DNA的体外和体内生物活性。结果 CTAB纯化质粒DNA的最佳浓度为0.004%;用NaCl、KAc或LiCl提取的质粒DNA中,RNA均未完全去除,而用CaCl2或MgCl2提取的质粒DNA中,RNA含量(RNA/nucleic acid)均小于1%,CaCl2最佳终浓度范围为0.4～0.5 mol/L,MgCl2最佳浓度范围为0.3～0.4 mol/L;使用0.4 mol/L MgCl2的CTAB法纯化的质粒pEGFP的杂蛋白质、细菌基因组DNA、内毒素和RNA含量均符合FDA对治疗用质粒DNA的要求;纯化的质粒pEGFP DNA回收率达80%以上,且体外生物活性显著高于市售试剂盒纯化的质粒(P<0.05),而体内生物活性与试剂盒纯化的质粒相当(P>0.05)。结论优化了CTAB法纯化质粒DNA的工艺,该方法操作简便,经济高效,纯化得到的质粒DNA各项指标均符合FDA质量标准,且转染基因表达效率较高,质量可靠,适用于质粒DNA的大规模纯化生产。 展开更多
关键词 十六烷基三甲基溴化铵 质粒 DNA 纯化 基因治疗
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一种改良的纯化质粒DNA方法 被引量：2
17
作者 吴斌华 李祥勇 周克元 《检验医学与临床》 CAS 2010年第17期1806-1807,共2页
目的介绍一种改良的纯化细菌质粒DNA的方法。方法针对传统的PEG纯化方法,取消PEG8000的纯化步骤,增加溶菌酶的浓度及酚-氯仿处理次数。结果新的纯化方法提取的质粒量比传统方法要多,而且纯度足以用于细胞研究。结论尽管目前已有质粒纯... 目的介绍一种改良的纯化细菌质粒DNA的方法。方法针对传统的PEG纯化方法,取消PEG8000的纯化步骤,增加溶菌酶的浓度及酚-氯仿处理次数。结果新的纯化方法提取的质粒量比传统方法要多,而且纯度足以用于细胞研究。结论尽管目前已有质粒纯化试剂盒出售,但经改良的传统质粒纯化法仍然具有经济、实用的价值。 展开更多
关键词 质粒 纯化 PEG
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重组CARDsTX融合蛋白的表达纯化与复性 被引量：2
18
作者 牛健 于晓旭 +2 位作者 李雪 鲍会静 刘运德 《天津医科大学学报》 2014年第3期184-187,共4页
目的:构建pET28α-CARDs TX重组质粒,诱导CARDs TX融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将CARDs TX基因(MPN 372)克隆入pET28α载体,经8次点突变获得pET28α-CARDs TX重组质粒。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。利用亲和层析... 目的:构建pET28α-CARDs TX重组质粒,诱导CARDs TX融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将CARDs TX基因(MPN 372)克隆入pET28α载体,经8次点突变获得pET28α-CARDs TX重组质粒。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过SDS-PAGE和Western blot检测CARDs TX的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明pET28α-CARDs TX重组质粒的DNA序列完全正确,在BL21中CARDs TX融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。结论:成功构建出pET28α-CARDs TX重组质粒,且CARDs TX可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究CARDs 展开更多
关键词 CARDsTX 质粒构建 点突变 蛋白纯化 蛋白复性
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超顺磁性Fe_3O_4@SiO_2空心亚微球的制备及其在质粒DNA分离纯化中的应用 被引量：2
19
作者 刘曼丽 张玉玉 +1 位作者 刘春巧 刘长霞 《北京化工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期58-62,共5页
采用溶剂热法合成超顺磁性空心亚微球,然后通过正硅酸乙酯水解-聚合反应,在亚微球表面包覆SiO_2,形成核壳结构Fe_3O_4@SiO_2空心亚微球。以该Fe_3O_4@SiO_2亚微球为分离介质,实现了大肠杆菌(E.coli)质粒DNA的高效、快速分离。
关键词 Fe3O4@SiO2 超顺磁性空心亚微球 质粒DNA 纯化
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pET30a-EgG1Y162质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化 被引量：2
20
作者 周彦霞 孔慧芳 +6 位作者 赵商岐 郑佳 曹春宝 李玉娇 龚巧巧 丁剑冰 周晓涛 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2021年第3期287-291,共5页
目的构建pET30a-EgG1Y162原核表达质粒,对重组蛋白HIS-EgG1Y162进行诱导表达、纯化及活性鉴定。方法从细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA中克隆出EgG1Y162基因,构建pMD19-T-EgG1Y162克隆载体。通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将EgG1Y162基因片段连接... 目的构建pET30a-EgG1Y162原核表达质粒,对重组蛋白HIS-EgG1Y162进行诱导表达、纯化及活性鉴定。方法从细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA中克隆出EgG1Y162基因,构建pMD19-T-EgG1Y162克隆载体。通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将EgG1Y162基因片段连接入原核表达载体pET30a中,构建pET30a-EgG1Y162重组质粒,经双酶切及PCR鉴定并测序。将测序正确的重组质粒转化入BL21(DE3)大肠埃希菌的感受态细胞中,利用IPTG诱导表达蛋白,诱导后的菌液经超声破碎,采用12%SDS-PAGE分析蛋白表达情况。使用His Trap纯化柱纯化蛋白,并进行Western blot鉴定。结果PCR扩增出的EgG1Y162基因,片段大小为360 bp,与预期相符。经双酶切及PCR鉴定并测序,成功构建出pET30a-EgG1Y162原核表达载体。重组质粒转化菌经IPTG诱导,HIS-EgG1Y162重组蛋白在菌液上清中的表达量高于沉淀,且在IPTG(0.2 mmol/L)在28℃诱导6 h时在上清中表达量较高。当咪唑浓度为20 mmol/L时重组蛋白的洗脱效果良好。Western blot显示纯化的重组蛋白HIS-EgG1Y162能被相应抗体识别。结论成功构建了pET30a-EgG1Y162重组质粒,并诱导纯化出具有反应原性的重组蛋白HIS-EgG1Y162,为细粒棘球蚴EgG1Y162疫苗的研发奠定了实验基础。 展开更多
关键词 质粒构建 重组蛋白HIS-EgG1Y162 原核表达 纯化 鉴定
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